Перспективы использования молекулярно-генетических методов для определения качества бактериальных заквасок

Загрузка...

К.В. Беспоместных

В статье рассматриваются проблемы обнаружения и идентификации молочнокислых бактерий в бактериальных заквасках и пути их разрешения. Показаны существующие классические способы идентификации бактерий, а также современные методы молекулярно-генетического анализа, используемые для видовой идентификации и паспортизации микроорганизмов.

 

В современных условиях насыщения рынка отечественными и зарубежными продуктами, содержащими широкий спектр пробиотических штаммов разных родов и видов, назрела необходимость дополнения существующих схем контроля этапов видовой идентификации штаммов-продуцентов пробиотических продуктов для подтверждения наличия всех заложенных в технологическую документацию штаммов в заявленном количестве [1].

Примерно с начала 90-х годов разнообразие штаммов внутри видов увеличилось - в связи с тем, что для идентификации стали использоваться все более и более тонкие методы, например, секвенция 16S рРНК (секвенция 16S рРНК - определение нуклетидной последовательности гена 16S рРНК) и использование ДНК-зондов (ДНК-зонд - небольшая часть ДНК, которая используется для детекции комплементарной последовательности в реакционной смеси) для выделения индивидуальных штаммов, в связи с чем количество имеющихся у коммерческих поставщиков культур увеличилось.

Частично это разнообразие обусловлено процессом естественной изменчивости и может быть результатом мутации (мутация - наследуемое изменение нуклеотидной последовательности ДНК), конъюгации (конъюгация - процесс образования межклеточных контактов между донорной и реципиентной клетками плазмидами, через которые они и переходят из одной клетки в другую), трансформации (трансформация - введение в клетку-хозяина рекомбинантной ДНК - конструкции клонирующий вектор-встроенная ДНК) и межклеточной и/или плазмидной трансдукции (трансдукция - процесс переноса гена при использовании фагов). Все более важным становится целенаправленное генетическое воздействие на культуры. Таким образом, в настоящее время для изменения свойств различных микроорганизмов с целью создания их генетически модифицированных вариантов могут использоваться генная инженерия или технология рекомбинантных ДНК.

Для исключения потенциальных конфликтов с потребителями, используемые в изготовлении пищевых продуктов бактерии должны подвергаться только тем генетическим изменениям, которые разрешены в пищевой промышленности. Это означает, что генномодифицированные организмы (ГМО) должны содержать только ДНК того же рода и, возможно, небольшие отрезки встроенной ДНК.

Однако в молочной промышленности увеличивается стремление получить разрешение на обмен ДНК с любым родом микроорганизмов, связанным с ферментацией пищи, при условии, что бактерия-донор признана абсолютно безопасной.

Идентификация микроорганизмов, входящих в состав заквасочных культур, которая проводится в микробиологических лабораториях, основывается почти исключительно на классических или традиционных тестах по морфологическим, физиологическим и биохимическим признакам [3]. В отдельных случаях этого бывает достаточно для выдачи предварительного ответа о виде обнаруженного микроорганизма, но чаще всего изучение указанных признаков позволяет лишь наметить путь дальнейших исследований, которые уже выполняются с чистой культурой [3]. Следует отметить, что как набор признаков, так и способы изучения их варьируют в различных лабораториях, что значительно осложняет работу по диагностированию этих микроорганизмов, существенным условием совершенствования которого является стандартизация методов исследования свойств бактерий.

Используемые для изучения признаков бактерий основные среды должны быть адекватны в отношении необходимых источников питания. Часто в работах по диагностике видов молочнокислых бактерий имеются разногласия, которые обусловливаются тем, что отдельные исследователи применяют среды, неполноценные по своему составу. Работа по идентификации молочнокислых бактерий в значительной мере упростилась, если бы в различных лабораториях пользовались стандартными веществами [5].

Исследование большой коллекции штаммов, выделенных из кисломолочных продуктов и использующихся при изготовлении заквасок, показало, что бактерии видов Streptococcus thermophilus и Enterococcus durans, E. faecium, E. faecalis трудноотличимы при идентификации именно микробиологическими методами из-за схожих фенотипических характеристик. Нередки случаи обнаружения штаммов, обладающих свойствами, общими с энтерококками и стрептококками, что сильно затрудняет их идентификацию с использованием только фенотипических методов. То же можно отнести и к другим представителям молочнокислых бактерий. Например, учеными было обнаружено несоответствие данных, полученных методом молекулярно-генетического типирования при анализе последовательностей генов 16S рРНК и классических микробиологических характеристик при установлении видовой принадлежности мезофильных бактерий Lactococcus lactis ssp. lactis и L. lactis ssp. cremoris. Анализ микрофлоры кисломолочных продуктов домашнего изготовления выявил штаммы лактококков, способных к росту и ферментации молока при 45-47 0С, тогда как оптимальная температура роста для типовых представителей этих видов составляет 22-32 0С.

При идентификации лактобацилл только с использованием стандартных микробиологических тестов также могут возникнуть трудности. Например, идентификация близкородственных Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii ssp. delbrueckii, L. delbrueckii ssp. lactis, L. rhamnosus, L. plantarum, L. casei, L. paracasei на основании физиолого-биохимических свойств затруднительна вследствие общности их свойств [3].

Метод микроскопического исследования имеет преимущества и недостатки. Преимущества - простота; прямое выявление микроорганизмов; возможность разграничения микроорганизмов по морфологическим признакам. Недостатки - трудоемкость, длительность; низкая чувствительность; невозможность разграничения сходных микроорганизмов; необходимость высокой квалификации персонала лаборатории [6].

Для более точного определения видовой принадлежности требуются современные методы, основанные на полимеразной цепной реакции и секвенировании последовательности ДНК-генов.

В специализированных лабораториях, занимающихся выделением, изучением культур молочнокислых бактерий и отбором наиболее перспективных в производстве кисломолочных продуктов общего и функционального назначения, используются различные молекулярно-генетические методы, позволяющие устанавливать точную видовую принадлежность штаммов, а также типировать и паспортизировать производственные культуры.

Новый подход исследования упрощает проведение классических фенотипических анализов молочнокислых бактерий за счет применения коммерческих тест-систем, состоящих из большого набора дегидрированных реагентов, внесенных в стерильные планшеты. Добавление суспензии бактериальных культур позволяет быстро определять наличие реакции (рост, ферментативную реакцию и т.д.). Вместе с тем, более точная идентификация микроорганизмов, входящих в состав заквасок для кисломолочных продуктов, может быть достигнута в результате комплексных исследований, включающих наряду с фенотипическими анализами изучение геномных характеристик [3].

Существуют два основных типа таких тест-систем. Наиболее широкое распространение получили индивидуальные системы, рассчитанные на идентификацию одной культуры. Второй тип системы идентификации основан на использовании многорядных планшетов, в которых каждый ряд лунок позволяет идентифицировать одну культуру. Как правило, используются стандартные 96-луночные полистироловые планшеты. Для небольших и средних лабораторий более удобны индивидуальные тест-системы.

Идентификация выделенной культуры состоит из следующих этапов: приготовление суспензии и инокуляции лунок; инкубация; учет результатов тестов; интерпретация результатов.

Для приготовления суспензии, как правило, используется стерильный изотонический раствор, однако в некоторых случаях необходимо использовать специальные буферы или инокуляционные среды, входящие в состав набора.

В зависимости от конструктивных особенностей диагностического набора для инокуляции могут быть использованы градуированные пипетки, микродозаторы, пастеровские пипетки. В некоторых тест-системах инокуляция осуществляется методом погружения при помощи специального инокулирующего стержня.

Инкубация тест-систем проводится в обычных термостатах или в специальных термостатируемых устройствах, входящих в комплект некоторых автоматизированных систем идентификации. Температура и время инкубации, указанные в инструкции фирмы-изготовителя, должны выдерживаться максимально точно. Несоблюдение этих параметров является одной из наиболее частых причин неправильной идентификации культуры.

Учет результатов осуществляют либо визуально, либо при помощи специальных считывающих устройств - ридеров. Их использование позволяет избежать субъективизма при оценке реакции и, в конечном счете, повышает достоверность идентификации. После учета всех тестов производится кодирование результатов. В простейшем случае каждый положительный признак обозначают знаком +, а отрицательный - знаком ‒. Такое кодирование без использования компьютера делает заключительный этап идентификации весьма продолжительным и трудоемким.

Как правило, фирмы выпускающие системы для биохимической идентификации микроорганизмов, разрабатывают и специальное программное обеспечение для компьютерной обработки результатов. Основу таких программ составляет база данных содержащая частотную матрицу признаков для идентифицируемых микроорганизмов [2, 4].

При работе с микроорганизмами исследователи применяют методы, основанные на анализе нуклеиновых кислот: ДНК-гибридизации, методы полимеразной цепной реакции (ПЦР), включая ПЦР в реальном времени. Быстрые в исполнении методики на основе ПЦР являются альтернативой классическим микробиологическим методам и предпочтительны в случае необходимости немедленного получения результата. Метод позволяет решать задачи индикации бактерий, относящихся к указанному роду, и точной видовой идентификации [1].

В микробиологии методы ДНК-гибридизации имеют наибольшее значение для идентификации микроорганизмов с помощью генных зондов, позволяющих судить о присутствии или отсутствии определенных генов.

Поскольку геном каждого микроорганизма содержит уникальные видоспецифичные нуклеотидные последовательности, подобрав к ним соответствующие зонды, можно идентифицировать любой вид микроорганизма. Зонды должны быть специфичны в отношении генетического материала тех микроорганизмов, которые предполагается обнаружить.

В основе ДНК-методов лежат гибридизация участка генома с комплементарным к определяемой последовательности меченым олигонуклеотидным зондом и последующая детекция гибридизационного комплекса. В зависимости от типа метки зонда (производные флюорохромов) реализуются различные способы детекции результатов гибридизации (прямое измерение флюоресценции или хемолюминесценции). Важными преимуществами методов гибридизации являются: объективная оценка анализа; минимальное количество манипуляций в пределах каждого этапа анализа; возможность автоматизации.

В основе метода ПЦР лежит комплементарное достраивание ДНК-матрицы, осуществляемое in vitro с помощью фермента ДНК-зависимой ДНК-полимеразы. При многократном повторении циклов синтеза происходит экспоненциальное увеличение числа копий специфического фрагмента ДНК, что позволяет из небольшого количества анализируемого материала, который может представлять собой единичные клетки микроорганизмов, получить достаточное количество копий ДНК-фрагментов для идентификации их электрофорезом или иным способом.

Сегодня наиболее известный способ решения проблемы количественного определения ампликонов (ампликон - продукт ПЦР-копия участка искомой ДНК или РНК) в ходе проводимой реакции - Real-time ПЦР. Речь идет о регистрации накопления продуктов реакции в реальном времени и построении калибровочных кривых по результатам процессов, происходящих в каждой конкретной пробе. При этом используется технология, в основе которой лежат способность Taq-полимеразы гидролизовать последовательность ДНК в направлении 5&'-3&' и применение специальных зондов, модифицированных двумя флюоресцентными красителями, имеющими близкие поглощения и флюоресценции. При наличии специфической матрицы в начале амплификации (амплификация - процесс производства множества копий ДНК из участка искомой ДНК или РНК) происходит смещение максимума флюоресценции после деградации олигонуклеотидного зонда и, вследствие этого, отмена переноса энергии от одного флюорофора к другому. Анализ кинетики флюоресценции происходит в специальном амплификаторе. Это устройство позволяет рассчитывать количество исходной матрицы, используемой в реакции амплификации.

Область практического применения Real-time ПЦР в пищевой микробиологии крайне ограничена: в настоящее время эти методы являются в основном инструментом научных исследований из-за высокой стоимости специализированного оборудования и сложности создания диагностических наборов [6].

Изучение штаммов молочнокислых бактерий с использованием комплексного подхода к идентификации и оценке производственно-ценных свойств (включающее как классические микробиологические, так и современные молекулярно-генетические и аналитические методы) дает возможность выявить культуры штаммов, перспективные для использования в качестве заквасок и отвечающие требованиям международных стандартов, российских ГОСТов [3].

Проблема разработки методов молекулярно-генетического анализа весьма актуальна и важна для лабораторий, занимающихся поиском и идентификацией новых штаммов молочнокислых бактерий с целью применения их как заквасок для производства кисломолочных продуктов.

Возможность использования молекулярно-генетических, иммунологических, биохимических и бактериологических методов в молочной промышленности обеспечит выбор оптимальных решений для изучения молочнокислых бактерий и повышения эффективности исследований.

 

Список использованной литературы

1. Точилина А.Г. Индикация и идентификация бактерий рода Lactobacillus с использованием полимеразной цепной реакции // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2008. - № 3. - С. 69-73.

2. Тамим А.Й. Йогурт и другие кисломолочные продукты / А.Й. Тамим, Р.К. Робинсон; под научн. ред. д-ра техн. наук, проф. Л.А. Забодаловой. - СПб.: Профессия, 2003. - 661 с.

3. Ботина С.Г. Видовая идентификация и паспортизация молочнокислых бактерий методами молекулярно-генетического типирования // Молочная промышленность. - 2008. - № 3. - С. 52-54.

4. Квасников Е.И. Молочнокислые бактерии и пути их использования / Е.И. Квасников, О.А. Нестеренко. - М.: Наука, 1975. - 389 с.

5. Глик Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / Б. Глик, Дж. Пастернак - М.: Мир, 2002. - 589 с.

6. Ефимочкина Н.Р. Молекулярно-генетические методы в идентификации пищевых патогенных бактерий // Вопросы питания. - 2007. - № 2. - Том 76. - С. 4-15.

Загрузка...
Комментарии
Отправить