МикроРНК человека

Загрузка...
РНК интерференция была открыта Fire et. al. в 1998 году (Fire et. al., 1998), и первоначально рассматривалась как особого рода механизм защиты против вирусов и транспозонов (Downward J., 2004). Дальнейшее изучение этого явления показало, что РНК интерференция является одним из видов регуляции жизнедеятельности клетки любого эукариотического организма, в том числе и человека (Bartel D.P., 2004).
 
По мере изучения явления пришли к выводу, что оно может представлять интерес не только в теоретическом плане, но и в практическом, так как, зная механизмы РНК интерференции, можно управлять регуляцией экспрессии генов клетки и исправлять ее, если произошел какой-либо сбой (John B. et al., 2004).
 
РНК интерференция служит для изучения генов, выяснения их функций. Также это явление послужило толчком для развития новой отрасли генной терапии. Сейчас создаются различные векторы, несущие кассеты с генами микроРНК, которые подавляют гиперэкспрессию некоторых онкогенов, или экспрессию химерных генов, приводящих к развитию злокачественных новообразований, или генов вирусов, что приводит к подавлению их репликации в клетках человека и животных (Coburn G.A., Cullen B.R., 2003; Lai E.C. et al, 2004; Lieberman J. et al., 2003; Wilson J.F., 2005)
 

МикроРНК человека: общие положения

 

Локализация и структурная организация генов микроРНК человека

 
История изучения генов, кодирующих малые РНК, начинается с открытия Виктором Амбросом и его коллегами, что ген lin-4, контролирующий развитие личинки Caenorhabditis elegans, не кодирует белок, а продуцирует микроРНК. 7 лет спустя был открыт другой ген этого животного – let-7, продукт которого участвует в переходе личинки от первичного личиночного возраста к вторичному. Гомологичные let-7 гены были обнаружены в геноме человека, дрозофилы и еще у 11 билатерально симметричных животных (Bartel D.P., 2004).
 
Если говорить о гомологии между генами микроРНК человека и животными, то нужно отметить, что она довольно велика. Постоянство генов микроРНК у разных видов свидетельствует о том, что кодируемые ими функции консервативны. Исследователи показали, что множество генов микроРНК эволюционно консервативны и некоторые из них схожи у червей и человека.
 
Гены микроРНК были экспериментально охарактеризованы у различных организмов и была показана возможность наличия аналогов у разных видов. Это может быть использовано для выявления и предсказания новых генов микроРНК, причем предсказания могут быть довольно точными (Weber M.J., 2005).
 
На сегодняшний день известно множество генов микроРНК человека. Они занесены в специальные базы данных в сети Интернет, и в них даны полные характеристики этих генов (http://www.ncbi.nlm.nih.gov /entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=gene; http://www.diana.pcbi.upenn.edu /miRGen.html; http://microrna.sanger.ac.uk /cgibin/sequences/mirna_summary. pl?org=hsa; http://www.ma.uniheidelberg.de/apps/zmf/argonaute/interface).
 
Существует представление, что большинство генов микроРНК произошли от известных генов, находящихся в независимых транскрипционных единицах. Около четверти генов микроРНК человека находится в интронах пре-мРНК. Есть данные о том, что гены микроРНК могут находиться в кластерах (Bartel D.P., 2004; Calin G. et al., 2004; http://www.diana.pcbi.upenn.edu/miRGen.html). Гены в кластерах могут быть родственными друг другу довольно часто, но не всегда, так же как и некластерированные.
 
Возможно следующее толкование кластерирования генов: гены находятся в кластерах, так как их микроРНК продуцируются из общего первичного транскрипта. В результате гены объединены под одним промотором (Bartel D.P., 2004).
 
Помимо кластеров, гены микроРНК находятся в экзонах или интронах других генов (Weber M.J., 2005) или в межгенных последовательностях (Devor E.J. et al, 2005).
 
Таким образом, гены микроРНК могут находиться а) в интронах ; б) в экзонах (Berezikov E. et al, 2005); в) в межгенных последовательностях; и быть а) одиночными; б) парными (Cai X. et al, 2004); в)полицистронными (Devor E.J. et al, 2005). Кроме того, Calin G. et al были выявлены 10 случаев нахождения генов в центромерах и теломеразных концах.
 
Следует отметить, что гены микроРНК располагаются в геноме человека не рандомно, а в определенном порядке. Например, хромосома 4 содержит меньше генов, чем хромосомы 17 или 19 (Calin G. et al., 2004).
 
Также отмечается размещение генов или кластеров генов микроРНК в определенных местах генома:
близко к так называемым fragile sites (FRAs) или внутри них (рис.1);
близко к сайтам интеграции HPV16;
близко к регионам, ассоциированным с раком (CAGRs – cancer-assciated genomic regions);
близко к гомеобоксам (НОХ) или в них (рис.2);
в экзонах, кодирующих UTR области мРНК (Calin G. et al., 2004).
 

Образование и процессинг первичных микроРНК

 
Как уже было сказано, гены микроРНК не отличаются по своей структуре от генов мРНК и первичные микроРНК и мРНК эквивалентны по своей структуре. Так же как и первичный транскрипт мРНК, pri-miRNA имеет сар и полиА-хвост.
 
Транскрипция pri-miRNA осуществляется РНК полимеразой II. Первичный транскрипт представляет собой РНК размером ~1 КЬ. Транскрипт служит субстратом для микропроцессорного комплекса (>700 кДа), состоящего из дцРНК специфической рибонуклеазы Drosha и дцРНК-связывающего белка DGCR8. Drosha имеет массу около 160 кДа и относится к 3 классу РНКаз. N-часть белка содержит богатый пролином регион (Р-богатый регион), а также регион, богатый серином/аргенином. DGCR8 содержит 2 ДНК-связывающих домена (Нап J. et al., 2004; Zeng Y., Cullen B.R., 2005). По данным Уеом K.-Y. et al., DGCR8 является кофактором для Drosha. DGCR8 связывается с Drosha в С-терминальном регионе. С-терминальный регион DGCR8 еще содержит два dsRBDs, ответственных за связывание pri-miRNA. На N-конце DGCR8 находится сигнал ядерной локализации (рис. 5). Таким образом, DGCR8 служит для того, чтобы: а) связать Drosha с дцРНК; б) стабилизировать Drosha и тем самым обеспечить его нормальную работу (Уеом K.-Y. et al., 2006).
 
В свою очередь Drosha является ферментом, непосредственно обеспечивающим процессинг и превращение pri-miRNA в pre-miRNA.
 
Для того, чтобы сформировать pre-miRNA, Drosha должен сделать два надреза на pri-miRNA. Для этого в у фермента в средней его части есть два домена RIIIDs, которые формируют внутримолекулярный димер. RIIIDа надрезает нить РНК с 3?-конца, а RIIIDb – с 5?-конца, причем надрезы производятся доменами независимо. Микропроцессорный комплекс способен.
 
Для того, чтобы комплекс узнал нужный участок pri-miRNA, вся pri-miRNA должна иметь вторичную структуру, в которой была бы терминальная петля ?10 нуклеотидам, и ствол, длиннее, чем у pre-miRNA, сформированной в дальнейшем из этой pri-miRNA. Drosha способен вырезать pre-miRNA из pri-miRNA в том случае, если ствол с терминальной петлей фланкирован с 5? и 3? концов некомлиментарными нуклеотидами. Для успешного узнавания Drosha их размеры должны быть 7-13 нуклеотидов с 5?-конца и 10-30 нуклеотидов с 3?-конца. Чем больше длина некомплиментарных участков с 5? и 3? концов, тем больше вероятность того, что Drosha вырежет структуру ствол-петля.
 
Определенную роль в связывании с Р-богатым регионом Drosha играет терминальная петля предполагаемого участка вырезания на первичном транскрипте микроРНК (Zeng Y., Cullen B.R., 2005).
 
Таким образом, процессинг pri-miRNA можно разделить на следующие этапы:
DGCR8 микропроцессорного комплекса находит на pri-miRNA ствол и с ввязывается с ним;
Р-богатый регион Drosha связываестя с петлей на вершине ствола (терминальной петлей);
 
В результате образуется pre-miRNA размером около 70 нуклеотидов с петлей на конце ствола и выступом в два нуклеотида на 3?-конце.
 

Структурная организация и процессинг предшественников микроРНК

 
Весь вышеизложенный процесс формирования pre-miRNA происходит в ядре.
 
Для дальнейшего преобразования в микроРНК эта структура должна выйти из ядра в цитоплазму. Чтобы pre-miRNA могла сделать это, она должна связаться с ядерным экспортным фактором Exportin 5, действующим вместе с GTP-связывающим кофактром Ran. Комплекс pre-miRNA/ Exportin 5/ Ran-GTP мигрирует в цитоплазму, где происходит гидролиз GTP, что индуцирует высвобождение pre-miRNA.
 
На связывание с pre-miRNA влияют следующие особенности ее строения: а) размеры ствола; б) наличие выступа в два нуклеотида на 3?-конце. Размеры петли никак не сказываются на способности Exportin 5 связываться с pre-miRNA.
 
Кроме этого, Exportin 5 выполняет и другую функцию. Он защищает pre-miRNA от ращепления экзонуклеазами в цитоплазме. Dicer не может начать процессинг pre-miRNA до тех пор, пока она не освободится от Exportin 5 (Zeng Y., Cullen B.R., 2004).
 
После того, как pre-miRNA отделяется от Exportin 5, в работу вступает Dicer. Dicer (молекулярная масса около 220 кДа) относится к 3 классу РНКаза III подобных эндонуклеаз и имеет следующие функциональные области в своей молекуле: а) DEAD-box; б) РНК-хеликазный/АТФ-азный домен; в) DUF283 – функция не известна; г) PAZ; д) два RIIID (RIIIDa и RIIIDb) и е) dsRBD.
 
РНК-хеликазный домен обладает АТРазной активностью и расплетает РНК. DUF283 подобен РНКазе III. RIIIDa и RIIIDb формируют внутримолекулярный димер, разрезающий дцРНК. Что касается dsRBD и PAZ доменов, то их изучение привело к гипотезе, согласно которой они нужны для узнавания и связывания субстрата. Есть данные о том, что PAZ домен узнает и связывается с двунуклеотидным выступом на 3?-конце pre-miRNA. Кроме того, 3?-выступающая часть влияет на реакцию расщепления Dicer pre-miRNA (Kim V.N., 2005; Vermeulen A. et al., 2005).
 
Суть процессинга pre-miRNA заключается в том, чтобы из структуры «ствол-петля» сформировать линейную дцРНК. Для этого Dicer должен отрезать терминальную петлю с частью ствола (Bartel D.P., 2004). Известно, что после работы Dicer продукт, в дальнейшем задествованный в РНК-интерференции, имеет в своем составе в среднем около 22 оснований. Исходя из этого, был предложен примерный механизм действия Dicer, согласно которому сначала происходит узнавание pre-miRNA PAZ доменом, а затем начинают работать RIIIDa и RIIIDb, отрезающие от pre-miRNA фрагмент около 22 (±1) оснований (рис.8) (Rose S. D. et al., 2005).
 

Функциональная роль зрелых микроРНК

 
После того, как образовалась микроРНК, она должна встроиться в эффекторный комплекс, известный как RISC. RISC представляет собой сложный мультиферментный комплекс (молекулярная масса около 160 кДа).
 
Процесс РНК-интерференции начинается с того, что двуцепочечная РНК взаимодействует с белком Ago2, имеющим структуру, подобную Dicer (есть предположение, что Dicer также может принимать участие в загрузке RISC (Rose S. D. et al., 2005)), и состоящим с ним в одном семействе Argonaute. Ago2 расплетает РНК (работает РНК-хеликазный/АТФ-азный домен, процесс энергозависим). Так как цепи две, то выбор цепи осуществляется следующим образом: происходит отсоединение фермента от РНК после ее локального расплетения на участке 4-5 пар нуклеотидов (после работы Dicer двойная РНК симметрична). Если цепи полностью комплиментарны, то они соединятся друг с другом быстрее, чем к ним опять присоединится Ago2 (определенную роль в стабильности концов играет наличие нестабильных пар G:U (Kim V.N., 2005)). Ago2 «пытается» расплести РНК с двух сторон. Так как RISC начинает формироваться на 5?-конце, то в него будет включена соответствующая цепь (рис. 9) (Khvorova A. et al.,2003).
 
Кроме Ago2, в RISC входит множество белков семейства Argonaute, нуклеаз. Основную роль в работе комплекса играет, по-видимому, Ago2 (Kim V.N., 2005).
 
Являясь составным компонентом активного RISC* (RISC без нее не активен), микроРНК комплементарно спаривается с мРНК, запуская РНК интерференцию или подавляя трансляцию кодируемого мРНК белка (Bartel D.P., 2004). Как было показано John B. et al., связывание RISC* с мРНК происходит преимущественно в UTR-последовательности по сравнению с транслируемой областью мРНК (John B. et al., 2004). Связывание с UTR не приводит к разрушению мРНК, а только репрессирует ее трансляцию. Если RISC* присоединяется к транслируемой области мРНК, то, в случае ее высокой комплиментарности с включенной в RISC* РНК, происходит ее разрезание и деградация; а если комплиментарность низкая – ее трансляция останавливается без разрезания (Bartel D.P., 2004).
 
Посредством RISC* в клетке может регулироваться множество функций. Так, среди генов-мишеней микроРНК в составе RISC* есть гены белков цитоскелета, белков-регуляторов экспрессии (цинковые пальцы), различных транскрипционных факторов, ферментов, клеточных рецепторов, антител и др. (таблица S1 из John B. et al., 2004)).
 
Существует предположение, базирующееся на данных компьютерного анализа генома и на том, что некоторые гены имеют несколько сайтов связывания RISC*, что степень контроля генов путем РНК интерференции очень велика, однако насколько это вероятно – не известно, так как если гены имеют более 1-2 сайтов-мишеней, то число генов микроРНК должно во много раз превышать число остальных генов (более 35000 для человека), то есть гены микроРНК должны составлять основную часть генома (John B. et al., 2004).
 

Практическое использование микроРНК в функциональной геномике и генной терапии

 
С тех пор, как было установлено, что двуцепочечные РНК могут индуцировать молчание генов в клетках Caenorhabditis elegans, было предложено использовать это явление, как мощный инструмент для изучения функций генов в живых организмах (Coburn G.A., Cullen B.R., 2003). При помощи этого метода возможно изучение самых разнообразных генов, включая гены самих микроРНК (Lai E.C. et al, 2004).
 
Метод изучения генов с помощью РНК интерференции применяется для широкого круга организмов, включая человека. Однако, для того, чтобы применять данный метод, нужно, чтобы в клетке была микроРНК против определенного гена. Для этого используются синтез микроРНК непосредственно внутри клетки. Для доставки соответствующих генов в клетки организма используются векторные системы на основе вирусов (Wilson J.F., 2005). В таких системах используется вставка, имеющая собственный промотор.
 
Кодирующая РНК часть состоит из смысловой и антисмысловой последовательностей (образуют ствол), разделенных спейсером (промежутком) (образует петлю). При транскрипции такого участка образуется РНК, которая приобретает вторичную структуру, подобную pri-miRNA, и действует соответствующим образом (рис. 10, рис. 11) (Kawasaki H., Taira K., 2003; Paddison P., Hannon G.J., 2002).
 
Большое значение имеет использование микроРНК в генной терапии. МикроРНК могут применятся для: а) подавления работы онкогенов; б) подавления развития вирусов в клетках; в) корректировки биохимических процессов (Coburn G. A., Cullen B.R., 2003; Lieberman J. et al., 2003; Wilson J.F., 2005). Кроме этого, микроРНК сами могут служить причиной возникновения некоторых заболеваний, например, раковых или генетических (Ying S.-Y., Lin S.-L., 2005).
 
Основной принцип генной терапии, основанный на применении микроРНК – подавить повышенную экспрессию гена (Lieberman J. et al., 2003). Однако применение микроРНК для лечения вирусных генов и борьбы с онкогенами, несмотря на эффективность метода, не лишено недостатков. Их причина кроется в повышенной способности к мутированию раковых клеток и способности к изменению генома у вирусов (Westerhout E. M. et al., 2005).
 
Заключение
 
В настоящее время явление РНК интерференции интенсивно изучается и, не смотря на то, что это явление было открыто относительно недавно, на сегодняшний день о нем известно уже довольно много. РНК интерференция представляет интерес не только в чисто теоретическом плане, позволяя понять отдельные аспекты функционирования генома, но и может играть роль инструмента, с помощью которого возможно управление отдельными генами, что является востребованным для решения задач прикладного плана в функциональной геномике и генной терапии. Кроме этого, еще предстоит изучать значение данного явления для такой области биологии, как эпигенетика, а также выяснить место РНК интерференции в эволюции.
 
Список литературы
 
1. Bartel D.P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, and functions // Cell. – 2004. – Vol. 116. – P. 281-297
2. Berezicov E., Guryev V., van de Belt J., Wienholds E., Plasterk R. H. A., Cuppen E. Phylogenetic shadowing and computational idemtification of human microRNS Genes // Cell. – 2005. – Vol. 120. – P. 21-24
3. Cai X., Hagedorn C. H., Cullen B. R. Human microRNAs are processed from capped, polyadenylated transcripts that can also function as mRNAs // RNA. – 2004. – Vol. 10. – P.1957-1966
4. Calin G. A., Sevignani C., Dumitru C. D., Hyslop T., Noch E., Yendamuri S., Shimizu M., Rattan S., Bullrich F., Negrini M., Croce C.M. Human microRNA genes are freguently located at fragile sites and genomic regions involved in cansers // PNAS. – 2004. – Vol. 101, №9. – P. 2999-3004
5. Coburn G. A., Cullen B. R. siRNAs: a new wave of RNA-based therapeutics // Journal of Antimicrobial Chemotherapy – 2003. – Vol. 51. – P. 753-756
6. Devor J. E. Human microRNA polyadenilation signals // Molecular genetics and bioinformatics integrated DNA technologies. – 2005
7. Downward J. Science. Medicine, and future RNA interference. // BMJ. – 2004 – Vol. 328. – P.1245-1248
8. Fire A., Xu S., Montgomery M. K., Kostas S.A., Driver S. E., Mello C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. // Nature – 1998. – Vol. 386. – P. 806-811
9. Han J., Lee Y., Yeom K.-Y., Kim Y.-K., Jin H., Kim V. N. The Drosha–DGCR8 complex in primary microRNA processing// Genes & Dev.-2004-V.18-p.3016-3027
10. John B., Enright A. J., Aravin A., Tuschl T., Sander C., Marks D. S. Human MicroRNA Targets // PLoS Biology – 2004 – Vol. 2, № 11. – P. 1862-1879
12. Kawasaki H., Taira K. Short hairpin type of дцРНКs that are controlled by tRNAVal promoter significantly induce RNAi-mediatedgene silencing in the cytoplasm of human cells// Nucleic Acids Research – 2003 – V. 31, No.2. – P. 700-707
13. Khvorova A, Reynolds A., Sumedha D. Jayasena. Functional siRNAs and microRNAs exhibit strand bias//Cell.-2003.-V115.-p.209-216.
14. Kim V. N. MicroRNA biogenesis: coordinated cropping and digin. // Nature revitws. – 2005. – Vol. 6. – P. 1-11
15. Lai E. C., Wiel C., Rubin G. M. Complementary miRNA pairs suggest a regulatory role for miRNA:miRNA duplexes. // RNA – 2004. – Vol.10, №2. – P.171-175
16. Lieberman J.., Song E., Lee S.-K., Shasnkar P. Interfering with disease: oportuniyies and roadblocks to harnessing RNA interference. // TRENDS in Molec. Med. – 2003. – Vol. 9. – P.397-403
17. Paddison P., Hannon G. J. RNA interference: the new somatic cell genetics. // Cancer cell. – 2002. – Vol. 2. – P.17-23
18. Rose S. D., Kim D.-H., Amarzguioui M., Heidel J. D., Collingwood M. A., Davis M. E., Rossi1 J. J., Behlke M. A. Functional polarity is introduced by Dicer processing of short substrate RNAs // Nucleic Acids Research – 2005. – Vol. 33, №. 13. – P.4140-4156
19. Vermeulen A., Behlen L., Reynolds A., Wolfson A., Marshall W. S., Karpilov J., Khvorova A. The contributions of дцРНК structure to Dicer specificity and efficiency//RNA
20. Weber J.M. New human and mouse microRNA genes found by homology search// FEBS Journal
21. Westerhout E. M., Ooms M., Vink M., Das A., Berkhout B. HIV-1 can escape frjm RBA interferens by evolving an alternative structure its RNA genome. // Nucleic Acids Res. – 2005 –Vol. 33(2) – P. 796-804
22. Wilson J. F. Gene Therapy Yields to RNA Interference. // Annals of Internal Medicine – 2005 – Vol. 143, № 2 – p.161-164
23. Ying S.-Y., Lin S.-L. Current perspectives in intronic micro RNAs. // Journal of Biomedical Science – 2005
24. Yeom K.-Y., Lee Y., Han J., Suh M. R., Kim V. N. Characterization of DGCR8/Pasha, the essential cofactor for Drosha in primary miRNA processing// Nucleic Acids Research-2006-V.34No.16-p. 4622–4629
25. Zeng Y., Cullen B. R. Efficient processing of primary microRNA hairpins by Drosha Requires Flanking Nonstructured RNA sequences. // The journal of biological chemistry. – 2005. – Vol. 280, №. 30. – P. 27595-27603
26. Zeng Y., Cullen B. R. Structural requirements for pre-microRNA binding and nuclear export by Exportin 5. // Nucleic Acids Research – 2004. – Vol. 32 №. 16 – P. 4776-4785
Загрузка...
Комментарии
Отправить