Индуцированная изменчивость продуцента streptomyces lavendulae под воздейтвием уф-облучения

Загрузка...
1. Литературный обзор
1.1. Фермент холестеролоксидаза и его применение
1.2. Источники холестеролоксидазы
1.3. Свойства холестеролоксидазы
1.4. Ступенчатая селекция продуцентов ферментов
1.5. Индуцированная изменчивость продуцентов ферментов
2. Материалы и методы исследования
2.1. Объект исследования
2.2. Условия культивирования Streptomyces lavendulae продуцента холестеролоксидазы
2.3. Приготовление рабочей партии посевного материала на агаризованной питательной среде
2.4. Определение активности холестеролоксидазы по методу Ричмонда
2.5. Определение биомассы мицелия Streptomyces lavendulae
2.6. Исследование динамики ферментативной активности штамма в генерациях
2.7. Методика обработки культуры УФ-лучами
2.8. Статистические методы обработки результатов
3. Результаты и обсуждение.
3.1. Изучение индуцированной изменчивости продуцента холестеролоксидазы под воздействием ультрафиолета. Подбор времени облучения
3.2. Изучение индуцированной изменчивости Streptomyces lavendulae
3.3. Изучение стабильности ферментативной активности штамма в генерациях
4. БЕЗОПАСНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЙ
4.1. Характеристика условий труда
4.2. Микроклимат в помещении лаборатории
4.3. Вентиляция
4.4. Освещение
4.5. Безопасность работ с веществами и материалами
4.6. Категорирование и классификация лаборатории по взрывопожарной и пожарной опасности
4.7. Безопасность оборудования. Электробезопасность
4.8. Безопасность работы на персональном компьютере (ПК)
 
 
В настоящее время на кафедре биотехнологии ведутся исследования по разработке эффективной технологии получения фермента холестеролоксидазы. Для эффективного биосинтеза необходимо использование высокоактивного штамма продуцента. Традиционным методом повышения продуктивности штаммов-продуцентов биологически активных веществ является ступенчатая селекция. Она заключается в последовательном отборе спонтанных мутантов и их последующей обработке мутагенами.

Целью настоящей работы является изучение индуцированной изменчивости продуцента холестеролоксидазы Streptomyces lavendulae под воздействием УФ-облучения с целью отбора активного клона для последующего создания конкурентоспособной технологии производства фермента.

1. Литературный обзор

1.1. Фермент холестеролоксидаза и его применение

Холестеролоксидаза - мономерный бифункциональный флавинадениндинуклеотид (FAD) зависимый фермент, принадлежащий к классу оксидоредуктаз, которые специфично воздействуют на CH-OH группы доноров с кислородом в качестве акцептора. Холестеролоксидаза катализирует окисление 3β-гидроксистероидов и изомеризацию интермедиата, холест-5-ен-3-она в холест-4-ен-3-он с образованием пероксида водорода в стехиометрических количествах, который затем может быть измерен и отнесен к исходной концентрации холестерина [1].

 

Реакция окисления холестерина холестеролоксидазой в присутствии кислорода

Рис. 1 Реакция окисления холестерина холестеролоксидазой в присутствии кислорода.

Фермент холестеролоксидаза широко применяется в клинической диагностике. Этому послужила простота фермента, его специфичность и высокая чувствительность. Холестеролоксидазу широко используют при определении холестерина в сыворотке крови, что позволяет предотвратить развитие атеросклероза, сердечнососудистых заболеваний и других нарушений в липидном балансе, а так же для определения риска возникновения инфаркта и тромбоза.

Изначально, для определения холестерина использовалась методика, основанная на цветной реакции Либермана-Бурхарда [2]. Однако для данной реакции было необходимо применение опасных составляющих, таких как серная кислота и уксусный ангидрид. Кроме этого, существовала возможность получения недостоверных результатов из-за присутствия в реакционной среде различных примесей мешающих определению [3]. Методики определения, основанные на ферментативных реакциях с участием холестеролоксидазы, показали большие преимущества над ранней методикой.

Холестеролоксидаа нашла применение и в других направлениях. Например, даный фермент используют при производстве предшественников гормональных стероидов из 3-гидрокси стероидных производных [4]. Так же холестеролоксидаза используется в органическом синтезе при окислении нестероидных соединений за счет проявления стабильности стерео- и энантиоселективного окисления в органических растворителях и детергентах в высоких концентрациях [5].

Поскольку определение холестерина имеет большое значение для клинического и пищевого анализа, ведется разработка электрохимических биосенсоров, действие которых основано на применении холестеролоксидазы и взаимодествии образующегося пероксида водорода с другими компонентами сенсоров [1].

1.2. Источники холестеролоксидазы

Ряд микроорганизмов, выделенных из различных сред, способны продуцировать фермент холестеролоксидазу. Впервые она была выделена в 1944 году ученым G. E. Turfitt из культуры Rhodococcus erythropolis [6]. Им была изучена способность данного фермента окислять холестерин. Многими исследователями была выделена холестеролоксидаза из различных видов Mycobacterium, изолированных из почвы [7]. У многих видов Rhodococcus была обнаружена холестеролоксидазная активность [8]. Некоторые микроорганизмы, способные продуцировать холестеролоксидазу, были выделены из пищи животного происхождения, например из куриного и свиного жира, масла. Как правило, это были микроорганизмы, относящиеся к роду Rhodococcus. Еще один фермент с высокой холестеролоксидазной активностью (3,68 ЕД/мл) был выделен из Micrococcus sp. Это первая холестеролоксидаза, выделенная из данного рода микроорганизмов, для которой оптимум pH и температуры составляли соответственно 7,0 и 50С [9].

Ричмонд и Флегг выделили холестеролоксидазу из Nokardia sp. и предложили ее использование для определения холестерина в сыворотке крови [10].

Также была выделена холестеролоксидаза из грамотрицательных бактерий, таких как Burkholderia и Chromobacterium sp. Ферменты этих микроорганизмов относятся к термотолерантным и растворяются в органических растворителях [11].

Холестеролоксидазы из различных источников, в том числе из Streptomyces griseocarneus, Streptomyces (Actinomyces) lavendulae, Streptomyces violascens, Streptoverticillium cholesterolicum и Rhodococcus (Nokardia) rhodochroses имеют различия в субстратной специфичности, молекулярной массе и биосинтетическим закономерностям.

Бактерии, продуцирующие холестеролоксидазу, разделяют на две группы: патогенные и непатогенные. Непатогенные бактерии используют холестерин как источник углерода (Streptomyces и быстрорастущие Mycobacteria), патогенные бактерии нуждаются в холестеролоксидазе для инфицирования макрофагов (Rhodococcus equi и медленнорастущие Mycobacteria). Патогенные бактерии нуждаются в холестеролоксидазе для заражения макрофагов из-за ее способности изменять структуру липидного слоя мембраны путем превращения холестерина в холест-4-ен-3-он. В присутствии холестерина патогенные и непатогенные бактерии могут регулировать экспрессию холестеролоксидазы [1].

1.3. Свойства холестеролоксидазы

Холестеролоксидаза микробного происхождения

Для холестеролоксидазы характерна относительная стабильность в жестких условиях среды, таких как высокие температуры и кислые или щелочные рН. Температурная стабильность этого фермента имеет большое значение в клинической практике. Оптимум температуры холестеролоксидазы лежит в пределах от 45 до 50С, оптимум рН - от 6,5 до 7,0 [12].

Фермент может храниться при температуре -20С до 6 месяцев без снижения активности, при температуре 5С в течение 6 месяцев со снижением активности на 10%. Холестеролоксидаза стабильна при температуре ниже 45С рН 7,0 15 минут и в диапазоне рН (5,0÷10,0) при 25С в течение 20 часов. Изоэлектрическая точка находится при рН 5,1±0,1 и 5,4±0,1.

В качестве ингибиторов холестеролоксидазы выступают ионы ртути Hg++ и серебра Ag+, а также ионные детергенты.

Молекулярная масса фермента составляет приблизительно 34 кДа. В лиофилизированном виде холестеролоксидаза представляет собой желтоватый аморфный порошок.

Локализация фермента в клетке

Различные микроорганизмы продуцируют холестеролоксидазу как эндогенный (интрацеллюлярный) либо экзогенный (экстрацеллюлярный) фермент. Холестеролоксидаза может быть связанна с внутренней мембраной клеток и располагаться в периплазматическом пространстве или обнаруживаться в фильтрате как экзоферменты.

Существуют эффективные методики экстракции холестеролоксидазы из клеток. Поэтому разумно использовать микроорганизмы, которые продуцируют эндогенный фермент. Выделение и очистка эндогенного фермента значительно легче, чем многостадийная очистка от примесей, содержащихся в нативном растворе.

Ранние исследования показали, что штамм Streptomyces lavendulae NCIM 2421 продуцирует как внутриклеточный, так и внеклеточный фермент [13].

Типы холестеролоксидаз и их структура

Для выполнения различных биологических функций белки используют в основном слабосвязанные кофакторы. В настоящее время известно до 30 флаво-ферментов, которые ковалентно связаны с гистидином, цистеином или тирозином боковой цепи [12].

Существуют две формы холестеролоксидазы, одна содержит ФАД в качестве кофактора, нековалентно связанный с ферментом (холестеролоксидаза I типа); холестеролоксидаза II типа содержит ковалентно связанный ФАД-кофактор. Холестеролоксидаза I типа обнаруживается в бактериях рода Streptomyces и Rhodococcus equi, фермент II типа выделен из Brevibacterium sterolicum. Холестеролоксидазы имеют схожую каталитическую активность, но различны по своей аминокислотной последовательности, окислительно-восстановительной способности и кинетическим параметрам [1].

Холестеролоксидаза I типа, продуцируемая бактериями рода Streptomyces, больше подходит для клинической диагностики ввиду низкой себестоимости и длительного срока хранения [1].

Повышение выхода холестеролоксидазы

Поскольку природные продуценты холестеролоксидазы имеют низкую активность фермента, были предприняты попытки по повышению выхода фермента с использованием разнообразных методик. Увеличение активности фермента можно достичь разными способами, один из которых оптимизация состава питательных сред [14]. В коммерческих средах используется добавление дорогих индукторов, таких как холестерин, для повышения выхода, что сказывается на себестоимости продукции [15]. Тем не менее оптимизация состава эффективна лишь до определеного уровня.

Учеными была расшифрована генетическая структура некоторых источников холестеролоксидазы, были сделаны попытки клонирования и экспрессии фермента для получения коммерчески выгодного штамма. Так, был клонирован и секвенирован ген холестеролоксидазы I типа и продемонстрирована продукция холестеролоксидазы в системе хозян-векторная ДНК [16]. Кроме того, представлена экспрессия гена холестеролоксидазы I типа и II типа в клетках Escherichia coli [17,18].

1.4. Ступенчатая селекция продуцентов ферментов

Традиционным способом получения штаммов продуцентов с повышенной активностью целевого фермента является ступенчатая селекция (отбор). Смысл ступенчатого отбора заключается в отборе спонтанных мутантов и их последующей обработке с помощью физически и химических мутагенов.

С помощью ступенчатого отбора удалось получить штаммы продуцентов с активностью ферментов в 5 и более раз больше, чем у исходного штамма [19].

1.5. Индуцированная изменчивость продуцентов ферментов

Частота спонтанных мутация обычно низкая, одна на 104-1010 клеток, при чем не всегда такие мутации приводят к повышению продуктивности штамма. Выявление спонтанных мутантов требует много времени и напряженного труда. С применением мутагенных факторов физической и химической природы можно значительно повысить частоту мутаций, при этом в основном возникают те же мутации, что и при естественной изменчивости.

Отбор среди большого числа вариантов, обработанных низкими дозами мутагенов, до сих пор остается наиболее плодотворным методом повышения продуктивности штаммов. Отбор случайных мутантов применяют в тех случаях, когда селекционер не располагает какими-либо сведениями о пути синтеза желаемого продукта, его регуляции и взаимосвязи с синтезом других метаболитов, то есть, возможно получение продуцентов генетически неизученных штаммов.

Поскольку физиологические признаки обычно контролируются полигенной системой, они сильно варьируют в количественном проявлении. Увеличение продуктивности может произойти вследствие малой мутации, то есть изменении в одном или нескольких генах этой системы. Процесс получения высокоактивных штаммов заключается в длительной селекции с применением мутагенов различной природы в несколько этапов, на каждом из которых отбирается наиболее продуктивный вариант. В результате такой селекции в геноме штамма накапливается множество малых, незначительных мутаций, что сопровождается ступенчатым увеличением продуктивности.

Однако у высокоактивных штаммов, подвергшихся многократному воздействию одного мутагена, темп отбора резко снижается. Это явление можно объяснить тем, что на определенном этапе отбора гены, ответственные за синтез продукта насыщены мутациями настолько, что последующая обработка ведет к возникновению обратных мутаций. Неэффективный отбор под действием одного и того же мутагена можно объяснить также накоплением мутаций в участке, ведущем себя как горячая точка, то есть мутирует только одна группа генов [20]. Поэтому важно применять разные мутагены, чтобы добиться различных генетических изменений во всей системе контроля синтеза фермента.

Увеличения темпа отбора можно добиться с помощью большой мутации. Такие мутации приводят к резкой перестройке генетического материала исследуемого штамма и вызывают увеличение его изменчивости по продуктивности. Известно, что большие мутации дают плейотропный эффект, то есть вызывают изменения ряда других признаков, в результате чего могут произойти резкие сдвиги в конституции микроорганизма, приводящие к нарушению физиологических корреляций, установившихся до возникновения этой мутации. Продуктивные штаммы часто приобретают морфологические изменения, например, оказываются малоспорулирующими или, наоборот, имеют повышенную споруляцию, могут потерять пигмент или приобрести новый, могут изменить величину или форму колоний.

В результате многочисленных исследований индуцированной изменчивости микроорганизмов были обобщены основные закономерности:

1) частота морфологических и физиологических мутантов с увеличением дозы мутагена вначале возрастает, затем снижается;

2) максимальное количество высокоактивных вариантов наблюдается при менее токсичных дозах мутагена, в то время как морфологических и низкоактивных - при более высоких дозах;

3) у малоактивных штаммов частота высокоактивных вариантов, как правило, превышает частоту низкоактивных, у высокоактивных - индуцируется больше низкоактивных вариантов;

4) в результате длительной селекции с использованием мутагенов темп отбора по какому-то определенному количественному признаку значительно снижается [20].

При выборе мутагена важно учитывать, какой тип мутации требуется получить, и какова эффективность выбранного мутагена в отношении данного штамма микроорганизма. Генотип штамма играет большую роль в индуцированной селекции, поскольку даже на штаммы одной культуры один и тот же мутаген может действовать по-разному.

По своей природе мутагены подразделяются на физические, химические и биологические.

В качестве физических мутагенов применяются ультрафиолетовое облучение и радиация.

Различные компоненты клеток неодинаково поглощают УФ-лучи. Интенсивнее всего их поглощают нуклеопротеиды. УФ-лучи вызывают образование димеров пиримидинов и являются мутагенами широкого спектра действия. Максимальная активность УФ-излучения как в отношении летального, так и мутагенного эффекта наблюдается при длине волны 265 нм. Использование этого мутагена приводит к образованию мутантов с транзициями, трансверсиями и делециями.

Эффективность УФ-облучения довольно высока, однако высокая частота мутаций достигается за счет низкой выживаемости клеток. Кроме того, такие мутанты хорошо восстанавливаются репарационными механизмами клеток. Фотореактивация снижает летальное и мутагенное действие УФ-лучей, поскольку видимый свет вызывает расщепление пиримидиновых димеров. Поэтому проведение эксперимента требует исключения источников видимого света. Важное значение имеет физиологическое состояние клеток, характер суспендирующей жидкости и плотность суспензии клеток.

Рентгеновское излучение и техника быстрых нейтронов приводят к разрывам хромосом, вызывая делеции и инверсии. Мутагенный эффект этого метода довольно высок, однако его применение требует специального оборудования.

Более широкое применение нашли химические мутагены: аналоги азотистых оснований, азотистая кислота, нитрозогуанидин, этилметансульфонат, акридиновые красители и т. д. Аналоги оснований вызывают транзиции и трансверсии а результате ошибок репликации, однако эффективность их действия очень низка. Гидроксиламин и азотистая кислота, вызывающие дезаминирование нуклеотидов, способствуют возникновению делеций и транзиций. Акридиновые красители вызываю интеркаляцию между основаниями во время репликации и способствуют возникновению мутаций со сдвигом рамки считывания. Наиболее эффективным из химических агентов является нитрозогуанидин, который вызывает алкилирование оснований в репликативной вилке и образует мутанты с транзициями, трансверсиями и делециями. Эффективность этого соединения очень высока. Этилметансульфонат, по сравнению с нитрозогуанидином, вызывает меньше множественных мутаций и способствует алкилированию гуанина. В результате чего с высокой частотой образуются транзиции и трансверсии.

Сильным мутагенным эффектом обладает также этиленимин. Он легко вступает в реакцию алкилирования с карбоксильными, сульфгидрильными и гидроксильными группами, вызывая в клетках многочисленные нарушения. Это очень токсичное вещество, и работа с ним требует определенных мер предосторожности. Удобным в работе мутагеном с широким спектром мутаций является перекись водорода.

Кроме того, было установлено мутагенное действие некоторых антибиотиков. Например, аминогликозидные антибиотики, в частности стрептомицин, вызывают ошибки считывания генетического кода в процессе синтеза белка рибосомами клетки. Также механизм воздействия стрептомицина связывают с прямым действием его с молекулами ДНК, либо вторичным эффектом: стрептомицин, присоединенный к ДНК, вызывает ошибки в ее транскрипции, и это ведет к синтезу измененных молекул ДНК-полимеразы или реперативного фермента.

ДНК-тропные антибиотики способны избирательно подавлять синтез нуклеиновых кислот в клетке. В связи с этим, изучалось мутагенное действие таких антибиотиков, как митомицин С, дауномицин, брунеомицин.

При обработке химическими факторами следует соблюдать условия, способствующие максимальному проявлению мутагенной активности. Большую роль в этом играют рН раствора, время обработки, температурный режим. Так, нитрозогуанидин при обработке энтеробактерий, дрожжей наиболее эффективен при рН 6,0-6,5, у актиномицетов - при 9,0, у псевдомонад - при 5,5. Иногда химический агент более активен в газовой фазе, а не в жидкой среде. У актиномицетов и коринебактерий, обработанных парами диэтилсульфита, появляется в несколько раз больше морфологических мутаций, чем при обработке в водном растворе.

Мутагенный и летальный эффекты различных мутагенов могут повышаться при их совместном применении. Так, эффект УФ-лучей значительно увеличивается при комбинированной обработке с этиленимином. Установлено модифицирующее влияние антибиотиков на генетический эффект мутагенов.

Доза воздействия физических мутагенов выражается в единицах излучения, соответствующих типу лучей. Доза химических мутагенов характеризуется концентрацией мутагена и временем экспозиции при соответствующей температуре.

При выборе дозы мутагена ориентируются на показатель выживаемости обрабатываемой культуры, который определяется процентным отношением числа колоний, выросших после посева обработанной мутагеном культуры клеток. Выживаемость зависит от дозы мутагена, от индивидуальной чувствительности штамма к летальному эффекту мутагена. В селекции используются дозы, обеспечивающие выживаемость клеток в диапазоне от 0,1 до 50-80%.

В современной селекции распространено применение биологических агентов - транспозонов и генов-мутаторов. Гены-мутаторы являются продуктом мутаций в генах, ответственных за репликацию ДНК либо участвующих в механизмах репарации. Транспозоны - это мобильные элементы ДНК, способные перемещаться и встраиваться в пределах генома. Перемещение мобильных генетических элементов может вызывать практически все типы хромосомных перестроек.

Внедрение транспозона приводит к нарушению последовательности гена, в результате чего образуются мутанты с двойным фенотипом: инактивация гена приводит к потере признака, который он кодирует; приобретение устойчивости к определенному антибиотику, которую кодирует ген транспозона, что облегчает отбор мутантов.

Помимо этого, вставка и вырезание транспозона может привести к различным генным мутациям.

Для осуществления транспозонного мутагенеза необходим вектор для доставки транспозона. В качестве таких векторов часто используют фаги или плазмиды, которые можно легко выделить из бактерии-реципиента.

Важнейшей характеристикой полученных мутантов является их стабильность по селекционному признаку. Необходимо учитывать возможность реверсии даже после многоступенчатой селекции продуцента.

Примером многоступенчатой селекции с использованием мутагенов может служить работа с продуцентом амилолитических ферментов Aspergillus usamii. В результате обработки УФ-лучами, этиленимином совместно с Уф-лучами и диэтилсульфатом совместно с рентгеновыми лучами было достигнуто повышение активности декстриназы в 2,5 раза, мальтазы в 3 раза и амилазы в 6 раз.

С применением УФ-лучей и этиленимина были получены мутанты Aspergillus niger, синтезирующие по активности пектиназ исходный штамм на 40%. Дальнейшее использование высоких доз этиленимина привело к получению штаммов, превышающих контроль по активности на 80-150% [20].

Эффективное действие этиленимина в комбинации с УФ-лучами было показано на продуценте протеолитических ферментов Aspergillus terricola [].

УФ-облучением также получен высокоактивный штамм Streptomyces viridosporus T7A-81, синтезирующий комплекс ферментов (пероксидазу, эстеразу и эндоглюканазу), участвующих в деградации лигнина [].

Представленные сведения, говорят о том, что даже на нынешнем этапе развития биотехнологии большую роль в получении высокопродуктивных штаммов играет ступенчатый отбор. Как правило, на первых этапах работы с продуцентами используют УФ-лучи, вызывающие гибель до 99% клеток, а среди полученных мутантов отбирают имеющих необходимые фенотипические признаки.

2. Материалы и методы исследования

2.1. Объект исследования

Объектом настоящего исследования выступает культура Streptomyces lavendulae штамм 4I16, полученный на кафедре биотехнологии Санкт-Петербургской химико-фармацевтической академии в процессе изучения спонтанной изменчивости.

Streptomyces lavendulae - грамположительные бактерии, относятся к классу Actinomyces, выделены из почвы. На плотных питательных средах образует воздушный и субстратный мицелий. Окраска воздушного мицелия от белого до розовато-лилового и серого цвета. Субстратный мицелий желтовато-бурого цвета. На среде для хранения пигмента не образует. Культура обладает характерным землистым запахом из-за выделения летучего соединения геосмина. При культивировании в жидких питательных средах образует пеллеты. Культуральная жидкость соломенно-желтого цвета, с землисто-ананасным запахом.

2.2. Условия культивирования Streptomyces lavendulae продуцента холестеролоксидазы

Споровый материал выращивается на картофельном агаре №73 (КА) в течение 14 дней при температуре 28С.

Приготовление картофельного агара.

100 грамм картофеля отваривают в 1 литре водопроводной воды в течение 15 минут после закипания. Затем картофельный отвар фильтруют через марлю и растворяют компоненты в концентрациях (масс.-об. %):

пептон - 0,1%;

глюкоза - 0,5%;

MgSO4-7H2O - 0,04%;

K2HPO4 - 0,04%;

агар - 2,2%.

рН до стерилизации (7,4÷7,5).

Стерилизация при давлении 0,7 атм 30 минут.

Культивирование продуцента осуществляется с подращиванием посевного материала. Выращивание посевного материала и ферментация проводятся с использованием жидких питательных сред одинакового состава.

Приготовление посевной и ферментационной питательной среды.

Компоненты растворяют в необходимом количестве водопроводной воды. Концентрации компонентов (масс.-об. %):

глюкоза - 1%;

NH4NO3 - 0,2%;

CaCO3 - 0,2% (добавляется в каждую колбу отдельно);

дрожжи - 2,6%.

рН до стерилизации (6,4÷6,6).

Стерилизация при давлении 0,7 атм 30 минут.

Колба со 150 мл среды для выращивания посевного материала засевается ≈2 см2 спорового материала из пробирки. Продолжительность выращивания посевного материала 24 часа при температуре 28±1С на качалке при частоте вращения 200-220 об./мин.

Посевной материал в количестве 6% переносится в ферментационную колбу со 150 мл среды. Ферментация проводится в течение 23 часов при 28±1С на качалке при 200-220 об./мин.

2.3. Приготовление рабочей партии посевного материала на агаризованной питательной среде

Из свежей культуры на скошенном агаре в пробирке готовится суспензия спор в физиологическом растворе. Операция проводится на шейкере в течение 30 минут. Затем с помощью петли в асептических условиях осуществляется истощающий посев на агаризованную питательную среду № 73 (КА) в чашках Петри. Культура выращивается в течение 14 дней при температуре t=28±1С, после чего отдельные колонии асептично отсеваются с помощью петли в пробирки со скошенным агаром № 73 (КА). В пробирках культура выращивается в течение 14 дней при t=28±1С.

Активность полученных косяков проверяется после ферментации. Наиболее активным вариантом засевают колбу с жидкой посевной питательной средой и затем выращенным вегетативным материалом засевают пробирки со скошенным агаром № 73 (КА). Рабочая партия выращивается 14 дней при t=28±1С, после чего убирается в холодильник. Хранение осуществляется при температуре +4...+6С в течение 6 месяцев.

2.4. Определение активности холестеролоксидазы по методу Ричмонда

Определение активности холестеролоксидазы проводилось по методу Ричмонда [18]. Этот ферментативный метод основан на окислении холестерина холестеролоксидазой; образующийся в результате протекания реакции холестенон легко может быть определен спектрофотометрически по изменению светопоглощения при длине волны 240 нм.

Приготовление растворов для определения.

1) Раствор №1 - 0,1М фосфатный буфер рН (7,0÷7,2).

Готовится путем растворения в 1000 мл дистиллированной воды следующих компонентов:

Na2HPO4-12H2O - 21,48 г;

KH2PO4 - 5,4 г.

рН доводится концентрированной ортофосфорной кислотой (H3PO4). Раствор хранят в холодильнике при t=+4+6С.

2) Раствор №2 - 0,15% раствор твина 80 в 0,01М фосфатном буфере.

0,01М фосфатный буфер готовится путем разбавления раствора №1 дистиллированной водой. Раствор №2 хранится в холодильнике при t=+4+6С 1 неделю.

3) Раствор № 3 - 0,05% раствор тритона Х-100 в 0,05М фосфатном буфере.

0,05М фосфатный буфер готовится путем разбавления раствора №1 дистиллированной водой. После добавления тритона Х-100 раствор №3 перемешивается в течение 30 минут на магнитной мешалке. Готовый раствор хранится в холодильнике при t=+4+6С 1 неделю.

4) Раствор №4 - раствор холестерина в изопропаноле с концентрацией 1 мг/мл.

Все работы с изопропанолом проводятся под вытяжкой. Раствор №4 хранится в холодильнике во флаконе с притертой пробкой при t=+4+6С.

Ход определения.

Культуральную жидкость после ферментации фильтровали на нутч-фильтре. 0,5 г мицелиальной массы заливали 16 мл раствора №2 и экстрагировали на магнитной мешалке в течение 30 минут при комнатной температуре. Клетки продуцента затем отделяли фильтрацией через складчатый бумажный фильтр. Полученный экстракт разводили дистиллированной водой в соотношении 1:20. Определение активности проводили в экстракте и нативном растворе. Нативный раствор не разводили ввиду низкой концентрации в нем фермента.

Для определения активности спектрофотометрическим методом в кювету толщиной 1 см заливали 0,2 мл пробы, 2,75 мл раствора №3 и 0,05 мл раствора №4. Смесь тщательно перемешивали и устанавливали в спектрофотометр Shimadzu, включив секундомер. Через 30 секунд спектрофотометр обнуляли и через 1 минуту снимали показания. Активность холестеролоксидазы определяли по формуле:

А=1,25-ΔЕ-Р, (2.1)

где А - активность холестеролоксидазы, ХЕ/мл;

1,25 - коэффициент пересчета в минуты;

ΔЕ - показание спектрофотометра;

Р - разведение (только для экстракта).

За единицу холестеролоксидазной активности принимают такое количество фермента, которое способно окислять 1 мкмоль холестерина в минуту при заданных условиях.

2.5. Определение биомассы мицелия Streptomyces lavendulae

Определение биомассы проводилось с помощью влагомера термогравиметрического инфракрасного МА-45. Термогравиметрический метод заключается в определении потери массы, имеющем место при нагревании вещества. В этом процессе проба взвешивается до и после нагрева и рассчитывается разность между двумя значениями веса.

Ход определения.

Пробу мицелия, полученного после фильтрации культуральной жидкости, помещают на тарелку влагомера, отмечают начальную массу и сушат при t=130С. После окончания сушки записывают влажность и массу сухого мицелия. Далее пересчитывается масса сухого мицелия на 1 литр культуральной жидкости.

2.6. Исследование динамики ферментативной активности штамма в генерациях

Полученные активные клоны проверялись на стабильность ферментативной активности в генерациях (при пересевах). Для этого проводился пересев споровой культуры на скошенный картофельный агар несколько раз. За первую генерацию принимается колония, выросшая на чашке Петри в результате проведения моноспорового рассева. Поскольку определение активности в глубинной культуре на данном этапе невозможно, за контроль принималась активность второй генерации при первом пересеве в пробирки со скошенным агаром.

Ферментативная активность каждой генерации проверялась после ферментации с использованием вегетативного посевного материала в трех повторностях.

2.7. Методика обработки культуры УФ-лучами

Для облучения была взята 14-ти дневная споровая культура Streptomyces lavendulae. На шейкере в течение 30 минут был произведен смыв спор физиологическим раствором. Суспензия спор асептично разливалась по 4 мл в стерильные чашки Петри и устанавливалась под ультрафиолетовой лампой на расстоянии 5 см. Облучение проводили при открытой крышке чашки при постоянном перемешивании и отсутствии источников видимого света разное время. Облученную суспензию наносили на чашки Петри с картофельным агаром в количестве 0,1 мл, затем инкубировали в течение 14 дней при температуре t=28±1С в изолированном от света месте.

Из необлученной суспензии спор в физиологическом растворе также приготовили разведение в концентрации 107 и нанесли на чашку Петри с картофельным агаром. Контроль инкубировали в течение 14 дней при температуре t=28±1С.

На 14-сутки проводили подсчет выросших колоний, рассчитывали выживаемость спор культуры по формуле:

V=(n/N)-100%, (2.2)

где V - выживаемость спор, %;

n - количество колоний, выросших после облучения;

N - количество спор в исходной суспензии, не подвергавшейся облучению (определяется как количество колоний, выросших на чашке из необлученной суспензии, с учетом разведения).

Затем строились кривые выживаемости и определялась летальная доза облучения. На основании полученных данных осуществлялся подбор дозы облучения для проведения мутагенеза.

2.8. Статистические методы обработки результатов

Для обработки результатов исследования использовались статистические методы.

Задачей статистической обработки данных является выявление таких параметров, которые в достаточной мере характеризуют свойства полученной совокупности.

В рамках статистической обработки результатов вычисляются следующие параметры [40]:

- среднее арифметическое (Х);

- квадратическое отклонение (σ);

- коэффициент изменчивости (cv).

Среднее арифметическое значение (Х) является наиболее употребительной характеристикой и рассчитывается по формуле:

Х=(Ʃх)/n, (2.3)

где Ʃх - сумма всех значений для данного варианта;

n - количество значений.

Среднее квадратическое отклонение (σ) является мерой изменчивости какого-то признака. Среднее квадратическое отклонение находят по формуле:

 

(2.4)

Как правило, к плюс- и минус-вариантам относят все варианты, выходящие за пределы Х±2σ (для очень больших выборок Х±3σ).

Для большей точности определения разнообразия признака имеется понятие относительного среднего отклонения, выраженного в процентах и называемого коэффициентом изменчивости (cv), который рассчитывают по формуле:

 

(2.7)

Коэффициент изменчивости характеризует однородность полученного ряда данных. Чем меньше коэффициент, тем однороднее считается выборка. Если коэффициент больше 33%, то ряд данных считается неоднородным.

3. Результаты и обсуждение.

3.1. Изучение индуцированной изменчивости продуцента холестеролоксидазы под воздействием ультрафиолета. Подбор времени облучения

Вероятность спонтанной мутации в нормальном гене составляет 10-6-10-7. Такие мутации, как правило, остаются молчащими. Для повышения продуктивности более эффективным методом является селекция с применением мутагенов, среди которых на первое место ставят ультрафиолетовое излучение. Как отмечалось ранее, облучение использовалось в селекции многих продуцентов и, как правило, в результате удавалось повысить продуктивность штаммов в 1,5-6 раз.

При облучении ультрафиолетом решающим фактором является доза облучения. При изучении индуцированной изменчивости определяется летальная доза облучения и доза, при которой наблюдается наибольшая частота мутантов. По литературным данным, наибольший мутагенный эффект достигается при низкой выживаемости спор культуры (≈1%).

Для сравнения воздействия ультрафиолета на различные штаммы S. lavendulae проводили облучение исходной культуры (S. lavendulae ВКМ А-840Д) и активного штамма, выявленного в результате исследования спонтанной изменчивости (S. lavendulae 4I16).

В эксперименте использовалась ультрафиолетовая лампа PHILIPS TUV мощностью 30 Вт. Облучение суспензии спор разведения 107 в физиологическом растворе проводили с расстояния 5 см в течение 5-240 секунд, после чего наносили по 0,1 мл на чашки Петри с картофельным агаром и инкубировали в течение 14 суток при температуре 28±1С в изолированном от света месте, чтобы избежать фотореактивации. В качестве контроля использовали необлученную суспензию, которую также наносили на чашки и инкубировали. Затем производили подсчет колоний на чашках и рассчитывали выживаемость спор. Полученные данные представлены в таблице 3.1.

Таблица 3.1.

Выживаемость различных штаммов культуры S. lavendulae при облучении ультрафиолетом.

Рис. 2. Кривые выживаемости штаммов S. lavendulae ВКМ А-840Д (синий) и 4I16 (красный).

Анализ данных в таблице 3.5 и кривых выживаемости на рис. 9 показал, что исследуемые штаммы неодинаково реагируют на воздействие ультрафиолета. Штамм S. lavendulae ВКМ А-840Д (исходная культура) оказался более чувствительным по отношению к УФ-лучам. Из данных, представленных в таблице 3.5, видно, что 1% выживаемости у активного штамма достигается при более длительной обработке (15 секунд), нежели у исходной культуры (10 секунд). Летальная доза для штаммов также оказалась различной: для активного штамма S. lavendulae 4I16 составила 240 секунд, тогда как исходная культура S. lavendulae ВКМ А-840Д погибала уже при обработке в течение 210 секунд.

Таким образом, в результате эксперимента был подобран интервал времени облучения активного штамма ультрафиолетом, составивший 15÷20 секунд при расстоянии облучения 5 см.

3.2. Изучение индуцированной изменчивости Streptomyces lavendulae

Для обработки ультрафиолетом было выбрано время облучения равное 17 секундам.

Облучение суспензии спор разведения 107-109 в физиологическом растворе проводили с расстояния 5 см в течение 17 секунд, после чего наносили по 0,1 мл на чашки Петри с картофельным агаром и инкубировали в течение 14 суток при температуре 28±1С в изолированном от света месте, чтобы избежать фотореактивации. В качестве контроля использовали необлученную суспензию, которую также наносили на чашки и инкубировали.

После инкубации были получены колонии двух типов, описание которых представлено в таблице 3.1.

Таблица 3.1.

Типы колоний

Форма колонии

Диаметр, мм

Цвет воздушного и субстратного мицелия

Поверхность

Профиль

% типов колоний

Типичный

 

Округлая с концентрическими кругами

15÷17

От бледно-серого по краям до фиолетово-бурого в центре; темно-бурый

Шероховатая

Бугристый

85,7

Нетипичный

 

Округлая

13÷15

Беловато-серый; светло-желтый

Бархатистая

Выпуклый

14,3

С чашек Петри на скошенный агар были отсеяны колонии первого и второго морфологических типов. Активность отсеянных вариантов определяли в глубинной культуре с определением содержания фермента по методу Ричмонда.

На I этапе изучения индуцированной изменчивости проводили отбор наиболее активных клонов при ферментации с использованием вегетативного посевного материала в трех повторностях. Выращивание посевного материала и ферментация проводили согласно стандартной методике при температуре t=28±1C и 220 об/мин в течение 24 и 23 часов соответственно. Затем определяли активность холестеролоксидазы по методу Ричмонда.

На основании полученных данных была построена гистограмма, отражающая распределение вариантов по признаку образования фермента в сравнении с контролем.

 

Рис. 3. Распределение вариантов S. lavendulae по признаку ферментообразования после облучения культуры в сравнении с контролем

Анализ данных, представленных на гистограмме, показывает, что активность большинства полученных вариантов соответствует активности контроля. Наименьшая активность минус-варианта составила 78,5 % от активности контроля. А наилучший плюс-вариант показал активность, превышающую контрольную на 28 %.

На II этапе было проведено определение ферментативной активности выявленных плюс-вариантов в трех повторностях с использованием вегетативного посевного материала. Выращивание посевного материала и ферментация проводили согласно стандартной методике при температуре t=28±1C и 220 об/мин в течение 24 и 23 часов соответственно. Затем определяли активность холестеролоксидазы по методу Ричмонда. Полученные данные были статистически обработаны, результаты представлены в таблице 3.2.

Таблица 3.2.

Активность вариантов, полученных на II этапе отбора.

Вариант

Среднее арифметическое значение активности, Х, ХЕ/мл

Среднее квадратическое отклонение, σ

Коэффициент изменчивости, cv

Контроль

1,71±0,15

0,072454

4,24

УТI-1

1,87±0,09

0,047163

2,52

УТI-2

1,51±0,10

0,051383

3,40

УТI-3

1,81±0,29

0,146882

8,13

УТI-4

1,83±0,12

0,057737

3,15

УТI-5

1,82±0,17

0,084652

4,66

УТI-6

1,81±0,32

0,160667

8,90

УТI-7

1,76±0,34

0,172490

9,79

УТI-8

1,73±0,19

0,092831

5,36

УТI-9

1,70±0,33

0,166314

9,84

УТI-10

1,74±0,24

0,119242

6,84

УТI-11

1,36±0,21

0,106612

7,86

УТI-12

1,35±0,15

0,077289

5,71

УТI-13

1,31±0,19

0,097065

7,42

УТI-14

2,03±0,12

0,059219

2,91

УТI-15

1,58±0,06

0,031689

2,01

УТI-16

1,89±0,38

0,188957

10,01

УТI-17

2,34±0,25

0,125683

5,36

УТI-18

1,85±0,56

0,279502

15,36

УТI-19

2,02±0,39

0,192885

9,54

УТI-20

2,02±0,38

0,190328

9,44

В результате проверки были выделен наиболее активный клон S.lavendulae УТI-17. Его ферментативная активность превышала контрольную 36%.

На III этапе исследования был проанализирован уровень холестеролоксидазной активности у наиболее активного клона в пяти повторностях с использованием посевного материала при тех же условиях культивирования, что и на II этапе. Полученные данные представлены в таблице 3.3.

Таблица 3.3.

Активность вариантов, полученных на III этапе отбора.

Вариант

Среднее арифметическое значение активности, Х, ХЕ/мл

Среднее квадратическое отклонение, σ

Коэффициент изменчивости, cv, %

1

2

3

4

Контроль

1,74±0,32

0,160498

9,22

УТI-17

2,32±0,17

0,087216

3,76

При повторной проверке активного варианта S. lavendulae УТI-17 он так же показал высокую холестеролоксидазную активность, но несколько ниже, чем на II этапе исследования. При проверке в пяти повторностях активность превышала контрольную на 33%. Помимо этого вариант УТI-17 обладает низким уровнем изменчивости, характеризующимся коэффициентом изменчивости - 3,76%. Это говорит о стабильности показателей высокой холестеролоксидазной активности при ферментации.

3.3. Изучение стабильности ферментативной активности штамма в генерациях

При изучении изменчивости актиномицета для последующих этапов исследований, как правило, выбирают тот вариант, который обладает большей стабильностью, то есть сохраняет признак синтеза целевого продукта в последовательных генерациях.

С этой целью был сделан ряд последовательных пересевов полученного активного варианта с одной пробирки со скошенным агаром на другую. Затем проверялась ферментативная активность полученных генераций с использованием вегетативного посевного материала. Данные по холестеролоксидазной активности представлены в таблице 3.4. В качестве контроля за 100% была принята активность второй генерации, отсеянной с чашки Петри на скошенный агар после проведения облучения.

Таблица 3.4.

Динамика ферментативной активности S. lavendulae УТI17 в генерациях.

Характеристики

2-я генерация

3-я генерация

4-я
генерация

5-я
генерация

Активность, ХЕ/мл

2,32

1,81

1,39

0,27

Активность, %

100,00

78,02

59,91

11,63

Активность, % к исходной популяции

133,33

104,02

79,88

15,52

Результаты исследований показали, что полученный вариант оказался нестабилен. Уже после второй генерации наблюдается падение холестеролоксидазной активности ниже уровня контроля. В связи с этим возникает задача по разработке эффективной технологии хранения активной генерации штамма для проведения дальнейших исследований по изучению индуцированной изменчивости.

4. БЕЗОПАСНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЙ

4.1. Характеристика условий труда

Санитарная характеристика лаборатории определяется в соответствии с санитарными нормами, объем помещения должен быть не менее 15 м3/чел, площадь не менее 4,5 м2/чел.

Научная работа проводилась в лаборатории общей площадью 31,1 м2. Принимая количество человек, одновременно работающих в лаборатории, равным 3, на каждого приходится по 10,37 м2. Высота потолка в помещении составляет 3,5 м, т.е. общий объем его равен 108,85 м3. Следовательно, на одного работающего приходится 36,283 м3.

Таким образом, можно сделать вывод о том, что санитарная характеристика помещения соответствует нормативам.

4.2. Микроклимат в помещении лаборатории

Большая часть работ в лаборатории осуществляется сидя, стоя или связаны с ходьбой (к реактивам и оборудованию) и сопровождается некоторым физическим напряжением. Такой характер работ относится к категории 1б (интенсивность энергозатрат 140-174 Вт). Значение параметров микроклимата представлены в таблице 4.1.

Таблица 4.1.

Микроклимат в помещении лаборатории.

Нормируемый параметр

Величина

Категория работ: 1б

Оптимальная

Допустимая

Фактическая

Для холодного периода года:

температура, оС

 

 

относительная влажность, %

 

подвижность воздуха, м/с

 

21-23

 

 

40-60

 

0,1

 

19-24

 

 

15-75


0,1-0,2

 

20-22

 

 

50-60

 

0,1

Для теплого периода года:

температура, оС

 

 

относительная влажность, %

 

подвижность воздуха, м/с

 

22-24

 

 

40-60

 

0,1

 

20-28

 

15-75

 

0,1-0,3

 

23-25

 

 

55-65

 

0,15

Исходя из средних значений параметров микроклимата за период выполнения дипломной работы, можно сделать вывод, что микроклимат помещения соответствует допустимым параметрам.

4.3. Вентиляция

Воздухообмен в помещении смешанный (осуществляется естественное и механическое перемещение воздуха). Вентиляция приточно-вытяжная. Существуют местные механические вытяжные устройства в виде вытяжного шкафа и стерильного бокса.

4.4. Освещение

В лаборатории предусмотрено совмещенное освещение - боковое естественное и общее искусственное освещение.

При выполнении дипломной работы производились зрительные работы средней точности (наименьший объект различения - метка на лабораторной посуде).

Расчет фактических параметров освещения.

Естественное освещение.

 

где K - световой коэффициент;

Sостекления - площадь остекления, 8 м2;

Sпола - площадь пола, 31,1 м2.

 

Искусственное освещение.

Искусственное освещение обеспечивается 24 люминесцентными лампами мощностью 18 Вт.

Суммарная мощность ламп рассчитывается по формуле:

 

где Nсумм - суммарная мощность ламп, Вт;

N1 - мощность одной лампы, Вт;

nламп - количество ламп, 24.

 

Удельная мощность ламп рассчитывается по формуле:

 

 

Освещенность в помещении рассчитывается по формуле:

 

где Kз - коэффициент запаса (для люминесцентных ламп в помещении принимают 1,4).

 

Нормативные и расчетные характеристики освещения приведены в таблице 4.2.

Таблица 4.2.

Характеристика освещения.

Характеристика зрительных работ

Естественное освещение (световой коэффициент)

Искусственное освещение (освещенность, лк)

Норма

Расчетный

Норма

Расчетный

Размер объекта различения и разряд зрительной работы:

1мм, IV разряд

0,25

0,257

300

194,6

Характеристика фона и контраста:

Средние

-

-

-

-

Подразряд зрительной работы:

В

-

-

-

-

           

Искусственное освещение не соответствует норме, поэтому необходимо организовать дополнительное освещение в лаборатории. Для этого можно увеличить число ламп. Чтобы достичь нормативного показателя искусственного освещения, число необходимых ламп выводим из формулы:

Для достижения нормативного показателя искусственного освещения, число ламп в помещении необходимо увеличить до 38, при их мощности равной 18 Вт.

4.5. Безопасность работ с веществами и материалами

Потенциальная опасность работы с химическими реактивами связана с возможными утечками и выбросами токсичных и пожароопасных веществ из лабораторного оборудования, приводящими к:

- химическим отравлениям при загазованности и запыленности воздуха;

- ожогам при контакте с незащищенными кожными покровами;

- взрыву или пожару в помещении.

Поэтому все работы с использованием токсичных веществ должны проводиться в вытяжном шкафу. Легколетучие и легковоспламеняющиеся вещества хранятся в специальных вытяжных шкафах, в которых не проводятся работы, связанные с нагревом. Горючие вещества хранятся в специально отведенном месте в плотно закрытых темных бутылях вдали от нагревательных приборов.

При работе с опасными веществами используются индивидуальные средства защиты: халат, резиновые перчатки, очки или маска. Отработанные легковоспламеняющиеся и горючие жидкости, а также вредные вещества после их использования в работе собирают в специальные емкости для последующей переработки или нейтрализации. Остальные отходы сливали в городскую канализацию. Сведения о токсичных свойствах веществ и материалов приведены в таблице 4.3, информация о пожароопасных свойствах веществ представлены в таблицах 4.4 и 4.5.

В процессе выполнения биотехнологических работ происходит контакт с микроорганизмами-продуцентами, которые относятся к первой группе риска (низкий индивидуальный риск инфицирования).

Потенциальная опасность инфицирования в лаборатории связана с риском:

- ингаляционного воздействия аэрозолей микроорганизмов при засеве на твердые питательные среды, засеве на жидкие питательные среды, обжиге рабочих инструментов (крючков, лопаток-шпателей), открывании емкостей с культурами, фильтровании, взвешивании;

- попадания веществ в пищеварительный тракт с загрязненных поверхностей рук.

Сведения о методах безопасной работы с вредными веществами и микроорганизмами приведены в таблице 4.6.


Таблица 4.3.

Характеристика токсичных свойств применяемых веществ.

Наименование вещества

Агрегатное состояние в воздухе

ПДК,

(ОБУВ),

мг/м3

Класс опасности

Характер действия на организм человека

1

2

3

4

5

Агар микробиологичекий

Аэрозоль

6

4

Общетоксическое, аллергенное

Глюкоза кристаллическая

Аэрозоль

10

4

Общетоксическое, раздражает слизистые глаз и дыхательных путей

Дрожжи Saccaromyces cerevisiae

Аэрозоль

5000 КОЕ/м3

4

Аллергенное, общетоксическое

Изопропанол

Пары

50/10

3

Общетоксическое, проникает сквозь кожные покровы, вызывает раздражения, наркотическое опьянение,

кумуляция

Калия гидрофосфат

Аэрозоль

10

4

Общетоксическое

Калия дигидрофосфат

Аэрозоль

10

4

Общетоксическое

Магний сернокислый

Аэрозоль

2

3

Вызывает кожные заболевания и заболевания ЖКТ, общетоксическое

Мел

Аэрозоль

6

4

Общетоксическое, может вызывать атрофию ВДП

Микроорганизм Streptomyces lavendulae

Аэрозоль

5000 КОЕ/м3

4

Аллергенное

Натрия хлорид

Аэрозоль

5

3

Общетоксическое

Нитрат аммония

Аэрозоль

10

4

Общетоксическое, раздражающее действие на кожу

Пептон

Аэрозоль

0,5

3

Аллергенное

Холестерин

Аэрозоль

-

-

Раздражающее действие на ВДП

Холестеролоксидаза

Аэрозоль

 

 

Аллерген

Этиловый спирт

Пары

2000/1000

4

Общетоксическое, кумуляция

 

 

Таблица 4.4.

Пожароопасные свойства веществ. Газы и жидкости.

Наименование вещества

Плотность, кг/м

Растворимость в воде,

% масс.

Удельная теплота сгорания, кДж/кг

Температура, С

Удельное объемное электрическое сопротивление, Ом*м

Минимальная энергия зажигания, мДж

Пределы распространения пламени

Максимальное давление взрыва, кПа

Скорость нарастания давления взрыва, МПа/с

Минимальное взрывоопасное содержание кислорода, % об.

Примечание

кипения

самовоспламенения

воспламенения

вспышки

Концентрационные, %

Температурные, оС

Нижний

Верхний

Нижний

Верхний

1

Этиловый спирт

785

неогр.

29800

78,5

400

18

13

7,4-1011

0,264

3,6

17,7

11

41

628

15,8

11,1

ЛВЖ

2

Изопропанол

784,4

неогр.

34190

82,3

430

 

14

1,96-109

0,65

2,23

12,7

11

42

634

13,2

11,4

ЛВЖ


Таблица 4.5.

Пожаровзрывоопасные свойства веществ. Твердые продукты.

Наименование вещества

Плотность, кг/м

Растворимость в воде, % мае.

Удельная теплота сгорания, кДж/кг

Температура, С

Удельное объемное электрическое сопротивление, Ом*м

Минимальная энергия зажигания, мДж

Нижний концентр, предел распространения пламени,

г/м3 дисп., мкм

Максимальное давление взрыва, кПа

Скорость нарастания давления взрыва, МПа/с

Минимальное взрывоопасное содержание кислорода, % об.

Примечание

плавления

самовоспламенения

воспламенения

тления

1

Глюкоза кристаллическая

1571,4

 

15640

154

390

234

-

-

129

55

550

-

-

Аэровзвеси взрывоопасны

2

Холестерин

-

-

-

300

362

148,5

-

5,4-1013

-

-

-

-

-

Аэровзвеси взрывоопасны


Таблица 4.6.

Безопасность работы с химическими и биологическими веществами.

Наименование операции

Наименование веществ

Характер опасности

Условия хранения

Методы безопасной работы, нейтрализация веществ

Первая помощь. средства индивидуальной защиты.

1

2

3

4

5

6

Микробиологические манипуляции

Культура продуцента

Попадание на кожу, слизистые

В холодильнике на плотной питательной среде

Остерегаться попадания на кожу. Промыть раствором антисептика (спиртосодержащий гель для рук, 0,3% хлорамин)

-

 

Спирт этиловый

Распространение пламени на кожные покровы

В герметичной таре вдали от огня в прохладном месте. Объем не более 5 литров

Работы проводить с повышенной аккуратностью и внимательностью, с соблюдением техники безопасности и пожарной безопасности. Затушить пламя имеющимися средствами.

Охладить под струей проточной прохладной воды 15-20 минут, изолировать поврежденную поверхность от внешних воздействий.

Приготовление питательных сред

Агар микробиологический, глюкоза, дрожжи, дигидрофосфат, магний сернокислый, мел, нитрат аммония, пептон

При вдыхании аэрозолей оказывают общетоксическое и раздражающее действие на кожу и слизистые, в некоторых случаях аллергенное и канцерогенное

В плотно закрытой таре

Избегать попадания на кожу, ограничить время контакта.

При попадании на кожу и слизистые промыть большим количеством воды.

Таблица 4.6.

Безопасность работы с химическими и биологическими веществами (продолжение).

 

1

2

3

4

5

6

Определение активности холестеролоксидазы

Изопропанол, тритон X-100, твин 80, холестерин.

Раздражение при попадании на кожу и слизистые, общетоксическое; наркотическое опьянение при вдыхании паров.

В герметичной таре вдали от огня в холодильнике.

Работа в вытяжном шкафу; ограничить время контакта.

При попадании на кожу и слизистые промыть большим количеством воды. Использовать резиновые перчатки.

                 

 

4.6. Категорирование и классификация лаборатории по взрывопожарной и пожарной опасности

 

Категория помещения по взрывопожарной и пожарной опасности определяется свойствами веществ, используемых в работе. Все взрыво- и пожароопасные вещества используются в ограниченных количествах. Категория помещения по пожароопасности - В4 (удельная пожарная нагрузка 1-180 МДж/м2; категория определяется по этиловому спирту). По классу взрывоопасной зоны категория помещения В-1б (использование ЛВЖ в небольших количествах).

В лаборатории в качестве средств пожаротушения имеются огнетушитель ручной углекислотный ОУ-5, асбестовое одеяло. Также в общем коридоре рядом с лабораторией есть пожарный рукав и план эвакуации при ЧС.

4.7. Безопасность оборудования. Электробезопасность

Питание лабораторного электрооборудования и приборов осуществляется за счет переменного электрического тока с напряжением 220В и частотой 50 Гц.

Перечень электрооборудования и приборов, использовавшихся в работе:

- автоклав (закрытое исполнение, заземление);

- баня водяная;

- весы аналитические ВП-134 М (закрытое исполнение, заземление);

- качалочная машина с частотой вращения n=200-250 об/мин (закрытое исполнение, заземление);

- плитка электрическая (заземление);

- спектрофотометр Shimadzu (закрытое исполнение, заземление);

- сухожаровой шкаф (закрытое исполнение, заземление);

- влагомер термогравиметрический инфракрасный МА-45 (закрытое исполнение, заземление);

- электронный микроскоп (закрытое исполнение, заземление);

- рН-метр Эксперт 001 (закрытое исполнение, заземление).

Основные мероприятия, обеспечивающие безопасность лабораторного оборудования, представлены в таблице 4.7.

Таблица 4.7.

Безопасность лабораторного оборудования.

Операция, оборудование

Характер опасности

Предельное значение параметра

Основные технологические и организационные мероприятия, обеспечивающие безопасность

Приготовление питательных сред на водяной бане.

Термическая травма Т=110C

Температура

Использование хлопчатобумажных перчаток, чапельников и пинцетов. Нельзя оставлять без присмотра, после использования отключить плитку от сети.

Стерилизация в сухожаровом шкафу и автоклаве.

Термическая (Т=80С) и механическая травм (Ризб=0,3 МПа).

Температура поверхностей, избыточное давление

Теплоизоляция нагревающихся поверхностей при работе с автоклавом; точное соблюдение инструкций по эксплуатации; использование рукавиц при выгрузке; по окончании работы необходимо отключить оборудование от сети.

Стерилизация бокса бактерицидными УФ-лампами, проведение эксперимента по облучению культуры.

Острые и хронические поражения кожи, глаз, ЦНС

ПДУ

1 ВТ/м2

Вход в рабочую зону спустя 20 минут после облучения. В процессе облучения обязательно использование защитных очков, пелерины и перчаток.

4.8. Безопасность работы на персональном компьютере (ПК)

При работе с ПК на оператора действуют вредные физические производственные факторы (электромагнитные излучения и поля, нагрузка на зрение), и факторы трудового процесса (длительные статические и психологические нагрузки, гиподинамия).

Монитор компьютера имеет маркировку Low Radiation, что говорит о низком электромагнитном излучении и, соответственно, о меньшем вреде для оператора.

ПК располагается в просторном, хорошо проветриваемом помещении, площадь и объем на один компьютер соответствуют гигиеническим нормативам.

Освещение в помещении, где находится ПК, совмещенное (естественное и искусственное). Освещенность на поверхности рабочего стола в зоне размещения рабочего документа не менее 300-500 лк. Помимо общего искусственного освещения применяется местное искусственное освещение (настольная лампа). Для устранения солнечных бликов используются шторы. Рабочее место с ПК расположено таким образом, что свет из окон падает сбоку.

Для снижения зрительных нагрузок, прекращается работа в темное время суток.

Для уменьшения статических и психологических нагрузок при работе на ПК через каждые два часа делаются перерывы не менее 15 минут. Во время перерывов выполняются упражнения для глаз, рук и опорно-двигательного аппарата. В процессе работы чередуются различны виды деятельности (редактирование и ввод данных, считывание и осмысление).

Кроме того, подбирается удобная мебель в соответствии с комплекцией работника для уменьшения нагрузок на позвоночник.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

 

В рамках данной научной работы было проведено изучение индуцированной изменчивости Streptomyces lavendulae продуцента холестеролоксидазы под воздействием ультрафиолета, с целью получения высокоактивного клона для его дальнейшей селекции.

- Был подобран интервал времени УФ-облучения (15-20 секунд) для обработки активного штамма с целью проведения индуцированного мутагенеза.

- В результате проведения эксперимента по изучению индуцированной изменчивости был получен активный штамм продуцента Streptomyces lavendulae УТI17, активность которого превышает контроль на

Список использованной литературы

 

1. Lata Kumari Cholesterol Oxidase and Its Applications / Lata Kumari, Shamsher S. Kanwar // Advances in Microbiology. - 2012. - № 2. - pp. 49-65

2. Шапиро, Д. К. Практикум по биологической химии: 2-е изд. / Д. К. Шапиро. - Минск: Вышэйш. школа, 1976. -288 c.

3. Allain, C. C. Enzymatic determination of total serum cholesterol / С. С. Allain, L. S. Poon, C. S. G. Chan, W. Richmond, P. C. Fu // Clin. Chem. - 1974. - № 20. - pp. 470-475.

4. Fujishiro, K. Purification and properties of a new Brevibacterium sterolicum cholesterol oxidase produced by E. coli MM294/pnH10 / K. Fujishiro, H. Uchida, K. Shimokawa, M. Nakano, F. Sano, T. Ohta, N. Kayahara, K. Aisaka, T. Uwajima // FEMS Microbiol. Lett. - 2002. - № 215. - pp. 243-248.

5. Isobe, K. Purification and some properties of cholesterol oxidase stable in detergents from 3-Proteobacterium Y-134 / K. Isobe, K. Shoji, Y. Nakanishi, M. Yokoe, N. Wakao // Biosci. Bioeng. - 2003. - № 95. - pp. 252-263.

6. Turfitt, G. E. The Microbiological Degradation of Steroids. Oxidation of Cholesterol by Proactinomyces spp. / G. E. Turfitt // Journal of Biochemistry. - 1944. - Vol. 38, № 5. - pp. 49-62.

7. Schatz, A. The ability of Soil Microorganisms to Decompose Steroids / A. Schatz, K. Savard, I. J. Pinter // Journal of Bacteriology. - 1949. - Vol. 58, № 2. - pp. 117-125.

8. Ferreira, N. P. Numerical Taxonomy of Cholesterol-Degrading Soil Bacteria / N. P. Ferreira, R. P. Tracey // Journal of Applied Bacteriology. - 1984. - Vol. 57, № 3. - pp. 429-446.

9. Kanchana, R. Production and Partial Characterisation of Cholesterol oxidase from Micrococcus sp. Isolated from Goa, India / R. Kanchana, D. Correia, S. Sarkar, P. Gawde, A. Rodrigues // International Journal of Applied Biology and Pharmaceutical Technology. - 2011. - Vol. 2, № 2. - pp. 393-398.

10. Richmond, W. pparation and properties of a bacterial cholesterol oxidase from Nocardia sp. and its application to enzyme assay of total cholesterol in serum / W. Richmond // Clin. Chem.- 1973. - № 19. - pp. 1350-1356.

11. Doukyu, N. Characteristics and Biotechnological Applications of Microbial Cholesterol Oxidase / N. Doukyu // Applied Microbiology and Biotechnology. - 2009. - Vol. 83, № 5. - pp. 825-837.

12. Nishiya, Y. Improvement of thermal stability of Streptomyces cholesterol oxidase by random mutagenesis and a structural interptation / Y. Nishiya, N. Harada, S. Teshima, M. Yamashita, I. Fujii, N. Hirayama, Y. Murooka // Protein Engeneering. - 1997. - Vol. 10, № 3. - pp. 231-235.

13. Lartillot, S. Extracellular Cholesterol Oxidase from Streptomyces Strain / S. Lartillot, P. Kedziora // pparative Biochemistry and Biotechnology. - 1990. - Vol. 20. - pp. 51-62.

14. Chauhan, A. K. Medium optimization by orthogonal array and response surface methodology for cholesterol oxidase production by Streptomyces lavendulae NCIM 2499 / A. K. Chauhan, S. A. Survase, J. Kishenkumar, U. S. Annapure // J. Gen. Appl. Microbiol. - 2009. - № 55. - pp. 171-180.

15. Lee, M. T. Nutritional factors that affect the production of cholesterol oxidase by Rhodococcus equi no. 23 / M. T. Lee, W. C. Chen, C. C. Chou // Biotechnol. Appl. Biochem. - 1997. - № 3. - pp. 159-162.

16. Murooka, Y. Cloning and expssion of Streptomyces cholesterol oxidase gene in Streptomyces lividans with plasmid plJ702 / Y. Murooka, T. Ishizaki, O. Nimi, N. Maekawa // Appl. Environ. Microbiol. - 1986. - № 52. - pp. 1382-1385.

17. Sampson, N. S. Increased expssion of Brevibacterium sterolicum cholesterol oxidase in Escherichia coli by genetic modification / N. S. Sampson, X. Chen // Protein Expss Purif. - 1998. - № 12. - pp. 347-352.

18. Volonte, F. Production of recombinant cholesterol oxidase containing covalently bound FAD in Escherichia coli / F. Volonte, L. Pollegioni, G. Molla, L. Frattini, F. Marinelli, L. Piubelli // BMC Biotechnology. - 2010. - № 10. - p. 33.

19. Жукова, Р. А. Методы селекции продуцентов антибиотиков и ферментов / Р. А. Жукова, А. Д. Коммунарская, М. И. Пронина, И. М. Терешин, Н. П. Журавлева, М. Н. Шабас. - Л.: Медицина, 1978. - 160 с.

20. Алиханян, С. И. Селекция промышленных микроорганизмов / С. И. Алиханян. - М. : Наука, 1968. - 392 с.

21. Храмцова, Е. А. Селекция продуцентов : курс лекций / Е. А. Храмцова, Н. П. Максимова. - Мн.: БГУ, 2011. - 132 с.

Загрузка...
Комментарии
Отправить