Факторы дизрегуляции иммунного ответа при туберкулезе легких на различных этапах его реализации

Загрузка...

Известно, что патологическое течение противоинфекционного иммунитета и экспансия патогенов инфекционной природы наблюдаются при нарушениях иммунологической реактивности организма. В случае адекватного взаимодополняющего функционирования систем врожденного и адаптивного иммунитета, напротив, происходит эрадикация любого инфекционного антигена (вне зависимости от пути его проникновения в макроорганизм) на уровне первой линии защиты, как правило, в системе мукозального иммунитета, то есть иммунитета слизистых оболочек. Таким образом, при инфицировании Mycobacterium tuberculosis (МВТ) развитие и прогрессирующее течение туберкулеза легких (ТЛ) практически всегда связано с наличием у больного вторичной иммунологической недостаточности (ВИН). С другой стороны, в основе любого иммунопатологического процесса лежит первичная активация иммунных реакций, однако в случае туберкулезного воспаления она носит кратковременный и неэффективный характер и не приводит к полноценной реализации многостадийного иммунного ответа с образованием специфичных к антигену иммунокомпетентных клеток памяти. Установлено, что механизм иммунного дисбаланса при туберкулезной инфекции связан, прежде всего, с поляризацией иммунного ответа в направлении Treg- и Th2-зависимых его путей [Churina E.G. et al., 2012]. В свою очередь, избыточное количество регуляторных Т-клеток (Treg) при ТЛ может быть опосредовано нарушением процесса презентации антигена, в частности, активацией толерогенных (индуцирующих иммунологическую толерантность) дендритных клеток на стадии инициации иммунного ответа.

Презентация антигена является ключевым этапом иммунного ответа. Нарушение презентации антигена лежит в основе неадекватного иммунного ответа против патогена, в том числе МВТ. В числе основных антигенпредставляющих клеток (АПК) на сегодняшний момент рассматриваются дендритные клетки (ДК), которые определяют не только направленность дифференцировки Т-лимфоцитов, но и силу иммунного ответа, тем самым являясь своего рода его дирижерами.

При контакте с патогеном ДК связываются с его патоген-ассоциированными молекулярными паттернами (PAMP). Это взаимодействие осуществляется, в том числе, через экспрессированные на ДК рецепторы семейства Toll-подобных рецепторов (Toll-like receptors TLRs). В отношении MBT таким рецептором является TLR типа 2 (TLR2). В результате контакта TLR2 с PAMP MBT в ДК запускается процесс трансдукции сигнала активации клетки через систему адаптерных молекул и транскрипционных факторов, в частности NF-kB, что приводит к транскрипции генов-мишеней (генов главного комплекса гистосовместимости (MHC или у человека HLA human leukocytes antigens), молекул костимуляции семейства В7, секретируемых ДК провоспалительных цитокинов IL-12, IL-18, IL-27).

После взаимодействия с возбудителем функционально и фенотипически зрелые ДК экспрессируют молекулы гистосовместимости МНС в комплексе с микробными пептидами, которые презентируются наивным Т-лимфоцитам и распознаются их Т-клеточным рецептором (TCR). Для передачи Т-лимфоцитам адекватной информации об антигене важную роль играют экспрессируемые на зрелых ДК поверхностные молекулы костимуляции семейства B7 (CD80 и CD86), которые связываются со своими лигандами (CD28) на наивных Т-лимфоцитах-хелперах (Th0). Это служит сигналом к дифференцировке Th0 в Т-хелперы типа 1 (Th1) и их пролиферации с формированием клона антигенспецифических Т-клеток-эффекторов. Кроме того, активированные ДК продуцируют и секретируют цитокины, направляющие дифференцировку нулевых Т-хелперов (Th0) в надлежащем направлении, т.е. в Th1-клетки, и активацию последних.

На сегодняшний день одним из перспективных способов получения ДК для их последующего изучения является трансформация выделенных из периферической крови моноцитов в ДК в процессе их культивирования in vitro с добавлением ростовых факторов (интерлейкина 4 (IL-4), гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF)) и (для активации созревания ДК) липополисахарида (ЛПС).

В ходе проведенных исследований с использованием данного методического подхода было зарегистрировано, что у больных ТЛ вне зависимости от клинической формы (инфильтративный ИТЛ, диссеминированный ДТЛ) и варианта (лекарственно-чувствительный ЛЧТЛ, лекарственно-устойчивый ЛУТЛ) заболевания количество ДК, экспрессирующих молекулу CD209 (маркер зрелых миелоидных дендритных клеток), полученных из моноцитов крови в процессе их трансформации, оказалось выше, чем в группе здоровых доноров в 1,7 раза. Однако дальнейшее исследование их иммунофенотипа показало нарушение экспрессии на ДК ряда молекул, важных для инициации иммунного ответа.

Так, например, при анализе экспрессии TLR2 на ДК было выявлено снижение числа TLR2+ клеток у больных ТЛ вне зависимости от клинической формы и варианта заболевания в среднем в 2,5 раза по сравнению с нормой (т.е. у здоровых доноров). Предположительно, это может быть связано с шеддингом сбрасыванием рецепторов данного типа в результате действия МВТ. Возможно, что оно происходит уже на уровне моноцитов и сохраняется при последующей трансформации их в ДК [Druszczynska M. et al., 2013].

Необходимо заметить, что CD209 является не только маркером ДК, но также играет важную роль в распознавании и захвате М. tuberculosis. Однако (в отличие от TLR2) CD209-опосредованный сигнал, поступая в клетку, не активирует, а напротив, ингибирует процессы созревания ДК, т.е. является конкурентным по отношению к TLR2-зависимой активации клеток сигналом [Geurtsen J. et al., 2009; Balboa L. et al., 2010].

В ходе фенотипирования ДК также было зарегистрировано, что у больных ТЛ количество клеток, экспрессирующих молекулы главного комплекса гистосовместимости HLA-DR, было выше, чем у здоровых лиц, и составляло 93,60 (91,20-97,60) %, что позволяет сделать предположение об отсутствии нарушений со стороны презентирующей функции ДК. Наряду с этим, выявлено, что у больных ТЛ резко пониженной (в 1,8 раза относительно нормы) является экспрессия на ДК молекул костимуляции CD86, являющихся маркером зрелых иммуногенных ДК. Это позволяет заключить, что при ТЛ имеет место дефицит иммуногенных, т.е. запускающих иммунных ответ, ДК.

Известно, что отсутствие костимуляторного сигнала в ходе образования иммунного синапса между ДК и Т-лимфоцитами посредством молекул CD86 (на ДК) и CD28 (на Т-клетках) приводит к подавлению дифференцировки и пролиферации Т-лимфоцитов, супрессии уже активированных Т-лимфоцитов и их гибели.

Что касается толерогенных ДК, экспрессирующих другую молекулу костимуляции CD80 в отсутствие CD86 (т.е. CD80+CD86-), то у больных ТЛ их количество было в среднем по группе в 2,7 раза выше, чем у здоровых доноров). Выявлено, что молекула CD80 имеет высокое сродство к антигену CTLA-4 (Cytotoxic T-LymphocyteAntigen4 или CD152), экспрессируемому регуляторными Т-клетками с иммуносупрессорной активностью, индуцирующих состояние иммунологической толерантности [Sallusto F., Lanzavecchia A., 2002].

Известно, что в процессе созревания ДК начинают секретировать провоспалительные цитокины, в число которых входят, в частности, IL-12, IL-18, IL-27. Продукция цитокинов и других Th-инструктирующих факторов является наиболее важным из TLR2-регулируемых сигналов, позволяющих ДК индуцировать Тh1-клеточный иммунный ответ с генерацией Т-клеток-эффекторов.

В ходе проведенного исследования нами было показано, что концентрация IL-12 (в частности его биологически активного гетеродимера IL-12p70, состоящего из 2 субъединиц р35 и p40) в супернатантах культуральных суспензий зрелых ДК была повышенной (в среднем по группе больных ТБ в 1,6 раза по отношению с группе здоровых доноров), однако исключение составили группы больных с инфильтративным и лекарственно-устойчивым ТЛ, у которых данный показатель был, напротив, ниже нормы (12,50 (8,67-13,70) и 12,50 (8,67-13,70) пг/мл соответственно). Ничем не отличаются цифры!!!

С одной стороны, данное повышение является благоприятным при туберкулезной патологии, поскольку его эффекты, связанные с активацией Т-лимфоцитов, в последующем определяют элиминацию внутриклеточного инфектогена [Кетлинский С.А., 2005]. Вместе с этим, в нашей работе было показано, что у больных ТЛ, наряду с гиперсекрецией гетеродимера IL-12p70, регистрировалось повышение продукции его гомодимера IL-12p40, связывание которого с комплементарным цитокиновым рецептором на Т-лимфоцитах блокирует данный рецептор и препятствует передаче сигнала активации внутрь клетки [Pompei L., 2007; Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008].

Что касается других цитокинов ДК, то у больных ТЛ выявлялись разнонаправленные изменения продукции IL-18 (в зависимости от клинической формы заболевания) в условиях гипопродукции IL-27 (в среднем в 2,5 раза по сравнению с нормой). Известно, что IL-27 необходим для клональной экспансии CD4+ наивных Т-клеток, усиливает действие IL-12 на Т-клетки [Zhao J.,Zhao J.,Perlman S., 2012].

Таким образом, установленный у больных ТЛ дефицит активированных иммуногенных CD209+CD86+ ДК и секреции IL-27 в условиях гиперпродукции иммуносупрессорного гомодимера IL-12р40 и увеличения количества толерогенных ДК позволяет предположить сбой в механизмах инициации Т-клеточного ответа, опосредованный дисбалансом субпопуляций ДК и нарушением их функциональной активности.

Необходимо заметить, что Th1-активирующее действие IL-27 связано, в первую очередь, с индукцией под его влиянием экспрессии β2-субъединицы рецептора к IL-12 (IL-12Rβ2) на Т-клетках [Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008; Zhao J. et al., 2012]. Дефицит секреции IL-27, несомненно, оказывает негативное влияние на формирование полноценного рецептора к IL-12 на Т-лимфоцитах и активацию клеток. Тем не менее, результаты настоящего исследования позволили также установить нарушения внутриклеточного сигналинга в Т-клетках, не связанные с изменениями продукции Th1-ассоциированных цитокинов при ТЛ. Так, при специфической IL-12/IL-27-индукции лимфоцитов in vitro у больных ТЛ (независимо от клинической формы заболевания) регистрировалось снижение количества клеток, экспрессирующих β2-субъединицу рецептора к IL-12 IL-12Rβ2 (в 1,8 раза при ЛЧТЛ и в 2,1 раза при ЛУТЛ по сравнению с показателями в группе здоровых доноров). Вместе с тем, у больных ТЛ отмечался выраженный дисбаланс (относительно контрольных значений) в численности Т-лимфоцитов, экспрессирующих молекулы gp130 и WSX1, в комплексе составляющие активный рецептор к IL-27. Это проявлялось в уменьшении числа СD3+gp130+ лимфоцитов (в среднем в 1,6 раза) на фоне повышенного (в 2,1 раза) содержания Т-клеток с высокой экспрессией молекулы WSX1 (CD3+WSX1+hi), которая, как известно, в случае ее гиперэкспрессии опосредует не активацию, а подавление Т-клеточной пролиферации [Ссылка?]. При этом у больных ТЛ (в целом по группе) отмечалось снижение числа Т-лимфоцитов, содержащих активные формы транскрипционных факторов T-bet, STAT1, STAT4 и тирозиновых киназ Jak1, Jak2, Tyk2, участвующих во внутриклеточной трансдукции (проведении) сигналов активации Т-лимфоцитов, опосредованной цитокинами какими?

Таким образом, выявленное в настоящем исследовании снижение числа Т-лимфоцитов, экспрессирующих gp130-субъединицу рецептора к IL-27, на фоне гипопродукции самого цитокина и высокой экспрессии на Т-клетках ингибиторной молекулы WSX-1, на наш взгляд, может являться причиной снижения активности тирозиновых киназ Jak1, Jak2 и транскрипционных факторов STAT1, T-bet, что приводит к уменьшению экспрессии IL-12Rβ2. В свою очередь, низкая экспрессия IL-12Rβ2 на Т-лимфоцитах в сочетании с высокой секрецией супрессорного гомодимера IL-12p40 ДК у больных ТЛ, очевидно, нивелирует активационные эффекты IL-12р70, что приводит к еще большему снижению активности указанных тирозиновых киназ, а также киназы Tyk2, а, следовательно, к дефициту в клетках активируемых ими транскрипционных факторов STAT1, STAT4, T-bet и нарушению цитокин-опосредованной активации Th1-лимфоцитов в целом.

Что касается Также в ходе проведенных исследований у больных ТЛ продемонстрировано увеличение численности различных субпопуляций Treg и их функциональной активности. Так, выявленное увеличение числа CD3+CTLA4+ клеток при CD3/CD28-индукции Т-лимфоцитов in vitro свидетельствует об усилении супрессорной активности Treg. Механизм супрессии Th1-ответа посредством CTLA4 определенно вносит свой вклад в развитие иммунологической толерантности при ЛУТЛ, при котором отмечалось более выраженное увеличение числа CD3+CTLA4+ лимфоцитов. В данном случае мы можем судить о толерантности Т-клеток, индуцированной МВТ, устойчивыми к противотуберкулезным препаратам (ПТП), то есть с определенными биологическими свойствами, которые способствуют генерации Treg на периферии [Чурина Е.Г., 2012; Сахно Л.В. и соавт., 2011]. Косвенным доказательством этому может служить выявленная отрицательная взаимосвязь между общим содержанием CD3+ Т-лимфоцитов и количеством Т-клеток, имеющих фенотипы CD3+CTLA4+ и CD3+CD28-IL-2-, при лекарственно-устойчивом варианте инфильтративного ТЛ ИТЛ (r=0,68, p=0,0042 и r=0,56, p=0,0156 соответственно) и диссеминированного ТЛ ДТЛ (r=0,81, p=0,011 и r=0,57, p=0,019 соответственно). Кроме негативного активатора сигнальной трансдукции CTLA4 супрессорную активность регуляторных Т-клеток связывают с экспрессией внутриклеточного транскрипционного фактора Foxp3. Результаты исследований показали, что количество CD4+CD25+Foxp3+ Treg-лимфоцитов в крови у больных ИТЛ и ДТЛ вне зависимости от лекарственной чувствительности возбудителя в острую фазу заболевания возрастало относительно такового у здоровых доноров.

В связи с изложенным, логично предположить, что выявленные изменения способствуют формированию супрессии Тh1-зависимого иммунного ответа, возможно, с целью предотвращения развития гиперергических иммунных реакций и повреждения ткани легких. Однако в конечном итоге эта, в определенной степени компенсаторная реакция, связанная с усиленной пролиферацией и дифференцировкой Treg, приводит к негативным последствиям в виде ослабления эффективности протективного иммунитета, способствуя утяжелению туберкулезной инфекции [Чурина Е.Г., 2012; Vignali D.A. et al., 2008]. Очевидно, что повышение численности CD3+CTLA4+ и CD4+CD25+Foxp3+ Тreg в крови у больных ТЛ является прогностически неблагоприятным фактором. Известно, что одним из путей реализации эффекта Treg является тройное контактное взаимодействие (см. рисунок), в которое, наряду с Treg и клетками-мишенями, вовлекаются толерогенные дендритные клетки, численность которых у больных ТЛ, по данным исследования, была значительно выше, чем у здоровых лиц. Возможно, Treg препятствуют формированию иммунного синапса между толерогенной ДК и Т-клеткой. Как упоминалось выше, в основе этого механизма лежит конкурентное взаимодействие негативного активатора CTLA-4 с костимулирующими молекулами В7 (CD80/86) на поверхности ДК, способствующее формированию Т‑клеточной анергии [Miyara M., Sakaguchi S., 2011].

Таким образом, возрастающее количество Treg с иммунофенотипами CD3+CTLA4+ и CD4+CD25+Foxp3+ практически при всех клинических формах и вариантах течения ТЛ позволяет предположить, что именно они осуществляют главную иммуносупрессорную функцию при туберкулезной инфекции.

Интересно, что кроме установленного нами увеличения численности Treg при ТЛ повышается и их функциональная активность. Наряду с механизмом тройного контактного взаимодействия регуляторные Т-клетки осуществляют свои иммуносупрессорные функции путем секреции цитокинов-ингибиторов иммунного ответа и активации апоптоза Т-лимфоцитов.

Известно, что апоптоз и пролиферация иммунокомпетентных клеток обеспечивают поддержание иммунологического гомеостаза в организме и в норме протекают с приблизительно одинаковой интенсивностью. Как следует из полученных результатов, количество апоптотических и пролиферирующих клеток у больных с ЛЧТЛ не отличалось от соответствующих показателей в группе здоровых доноров. Интересен тот факт, что у пациентов с лекарственной резистентностью МВТ к ПТП, напротив, обнаруживалось более значительное (на 40-50 %) увеличение количества апоптотических клеток; доля пролиферирующих клеток при этом снижалась.

Активацию апоптоза лимфоцитов на фоне угнетения их пролиферативной активности у больных ЛУТЛ (особенно выраженную при ДТЛ) можно связать со способностью лекарственно-резистентных МВТ стимулировать апоптоз иммунокомпетентных клеток, а также с активацией и индукцией Treg [Сахно Л. В. и соавт., 2004]. Немаловажным является и то обстоятельство, что иммуносупрессорные эффекты Treg и лекарственно-устойчивых штаммов MBT являются однонаправленными в аспекте активации апоптоза и угнетения пролиферации лимфоцитов. В подтверждение этому анализ взаимосвязей между количеством CD4+CD25+Foxp3+ регуляторных Т-клеток и показателями пролиферации и апоптоза лимфоцитов крови у больных ТЛ установил наличие отрицательной корреляции между численностью Treg и пролиферирующих лимфоцитов (r=-0,68, p0,05) и положительной корреляции между количеством Treg и клеток в состоянии апоптоза (r=0,68, p0,05).

На основании результатов анализа секреции in vitro цитокинов, ассоциированных с Treg и обладающих иммуносупрессорной активностью, можно заключить, что у больных ТЛ имеют место разнонаправленные изменения их секреции в зависимости от клинической формы заболевания: при ДТЛ отмечается гиперпродукция IL-4 и TGF-β на фоне дефицита секреции IL-10; при ИТЛ повышение продукции IL-10 на фоне гипосекреции IL-4 и TGF-β. При этом выраженность регистрируемых изменений ассоциируется с лекарственной устойчивостью возбудителя ТЛ к ПТП.

Отметим, что активированные Treg-клетки сами по себе анергичны: in vitro они слабо пролиферируют и слабо секретируют цитокины, и лишь IL-10 и TGF-β секретируются Treg-клетками в значительных количествах [Maizels R.M., Smith K.A., 2011; Miyara M., Sakaguchi S., 2011], что подтверждается у больных ТЛ положительной корреляцией между уровнем продукции ТGF-β и количеством в крови регуляторных Т-клеток с иммунофенотипом CD4+CD25+Foxp3+ (r=0,90, p0,01).

Таким образом, можно заключить, что при туберкулезной инфекции нарушаются процессы костимуляции сигналов, необходимых для полноценной активации Т-лимфоцитов, но при этом формируются условия, благоприятные для реализации иммуносупрессорного действия регуляторных Т-клеток как на уровне ДК, т.е. стадии инициации иммунного ответа, так и в процессе дифференцировки и пролиферации эффекторных клеток.

 

Список литературы

1. Monocyte Signal Transduction Receptors in Active and Latent Tuberculosis [Electronic resource] / M. Druszczynska, M. Wlodarczyk, B. Janiszewska-Drobinska et al. // Clinical and Developmental Immunology. 2013. Mode of access:http://dx.doi.org/10.1155/2013/851452

2. Sallusto, F. The instructive role of dendritic cells on T-cell responses [Text] / F. Sallusto, A. Lanzavecchia // Arthritis Research. 2002. Vol. 4, Nо. 3. P. 127-132.

3. Кетлинский, С.А. Роль гетеродимерных цитокинов семейства IL-12 в развитии и регуляции врожденного иммунитета и TH1 иммунного ответа [Текст] / С.А. Кетлинский // Медицинский академический журнал. 2005. Т. 5, № 3. С. 13-25.

4. Кетлинский, С.А. Цитокины [Текст] / С. А. Кетлинский, А. С. Симбирцев. СПб: ООО Издательство Фолиант, 2008. 552 с.

5. Disparity in IL-12 release in dendritic cells and macrophages in response to Mycobacterium tuberculosis is due to use of distinct TLRs [Text] / Pompei L,Jang S,Zamlynny B et al. // J.Immunol. - 2007. Vol. 178, Nо. 8. P. 5192-5199.

6. Identification of mycobacterial alpha-glucan as a novel ligand forДК-SIGN: involvement of mycobacterial capsular polysaccharides in host immune modulation [Text] / J. Geurtsen, S. Chedammi, J. Mesters et al. // J. Immunol.  2009.  Nо. 183(8).  P. 5221-5231
7. Mycobacteriumtuberculosisimpairs dendritic cell response by altering CD1b,ДК-SIGNand MR profile [Text] / L. Balboa, M.M. Romero, N. Yokobori et al. // Immunol. Cell Biol.  2010.  Nо. 88(7).  P. 716-726. 

8. Zhao, J. Differential effects of IL-12 on Tregs and non-Treg T cells: roles of IFN-γ, IL-2 and IL-2R [Electronic resource] // J. Zhao, J. Zhao, S. Perlman // PLoS One. 2012. - Vol. 7, Nо. 9. - Mode of access: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23029447

 

Загрузка...
Комментарии
Отправить